PLATAFORMA DE ENSAYO DE CÉLULAS NERVIOSAS DE MÚLTIPLES REDES CON CAPACIDAD DE REGISTRO PARALELA.

Una placa (10) de análisis de red neuronal que comprende: una pluralidad de pocillos de registro (20) organizada en una pluralidad de filas de registro,

en la que cada pocillo de registro contiene una red de células neuronales (22) y una pluralidad de electrodos para registrar señales de potenciales de acción procedentes de la red de células neuronales; una pluralidad de pocillos (30) de amplificación organizada en una pluralidad de filas de amplificación, en la que cada pocillo de amplificación comprende uno o más amplificadores (32) para amplificar las señales de registro procedentes de los pocillos de registro, en la que la pluralidad de filas de registro y la pluralidad de filas de amplificación están alternadas, de manera que cada pocillo de registro está en posición adyacente a un pocillo de amplificación correspondiente; y una pluralidad de interconexiones (25), en la que cada interconexión conecta los electrodos de un pocillo de registro con los amplificadores de un pocillo de amplificación correspondiente

La presente invención se refiere al campo de las redes neuronales y, en concreto, al campo de los dispositivos de ensayo multielectrodo, con múltiples redes capaces de registrar las señales de potenciales de acción no multiplexadas, completamente paralelas. 5

En la última década, se ha llevado a cabo un avance consistente y decisivo en la validación de cultivos de células neuronales primarias como plataformas de investigación farmacológica. Las redes del cultivo son espontáneamente activas y producen unos patrones de potenciales de acción (AP) que cambian de una forma predecible y reproducible en respuesta a las perturbaciones físicas y químico / fisiológicas de su entorno. Haciendo 10 crecer dichas redes sobre matrices de microelectrodos integrados sobre sustratos. (Gross et al., 1977; Gross 1994), puede conseguirse un contacto íntimo con los electrodos, proporcionando unas relaciones de señal - ruido elevadas, una estabilidad a largo plazo y un tiempo de vida operativo de varios meses. La supervisión de muchas células nerviosas de dichas redes produce unos rendimientos de patrones espaciotemporales copiosos, unas respuestas de superpoblación sutiles, y una tolerancia a los fallos general, en cuanto el análisis de todos los datos se basa en 15 grupos de células más que en las neuronas aisladas. Están surgiendo aplicaciones realistas con respecto a los campos de la toxicología, la farmacología y el desarrollo de fármacos (Gross et al., 1997; Morefield et al., 2000; Gramowski et al., 200; Keefer et al., 2001a, b, Gross y Gopal, 2006).

Así mismo, se ha sabido que dichas redes funcionan como biosensores, en cuanto responden a cualquier 20 compuesto que pueda alterar la función normal del sistema nervioso y no requieren un conocimiento a priori (o “huellas digitales”) de los agentes con los que se encuentran (Gross et al., 1997, Gross y Pancrazio, 2006). Representan los biosensores de “ancho de banda” de interés para el ejército y la seguridad nacional. Ya existe un prototipo de estación de sensores automáticos y autónomos en el Laboratorio de Investigación Naval [Naval Research Laboratory] (colaboración de NRL / UNT con arreglo al Programa de Detección de Actividades DARPA 25 [NRL / UNT collaboration under DARPA Activities Detection Program]).Como sistemas complejos, espontáneamente activos, las redes incorporan así mismo el misterio de la generación de patrones, el tratamiento, y el almacenaje, y con ello las etapas iniciales y las estrategias del tratamiento de la información.

Unas matrices de dos redes para registrar simultáneamente a partir de dos redes separadas (32 electrodos 30 cada una) se utilizan rutinariamente en instituciones seleccionadas. Sin embargo, esta propuesta dista mucho todavía de lo que se necesita para una explotación y unas aplicaciones eficientes de la dinámica de las redes. Las evaluaciones estadísticas de la repetibilidad entre cultivos, las aplicaciones de múltiples medicamentos y de concentraciones secuenciales, y de la evolución temporal de las respuestas tóxicas son tediosas y excesivamente lentas para las actuales necesidades industriales e incluso investigatorias. 35

Claverol - Timturé et al., 2005, divulga una placa de análisis de redes neuronales que comprende unas matrices multielectrodo con superposiciones microestructuradas elastoméricas para los registros extracelulares a partir de las neuronas en patrones.

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Una rémora financiera y temporal importante asociada con el desarrollo de los fármacos y con la evaluación toxicológica es la ausencia de unas plataformas de ensayo fisiológicas que estén situadas entre el bioquímico y los experimentos con animales o personas con el fin de proporcionar unos datos cuantitativos rápidos sobre las respuestas neuroactivas / neurotóxicas. Lo que la técnica necesita es una plataforma que utilice la dinámica de las redes neurofisiológicas complejas y sensibles (suministradas por el registro simultáneo de plantaciones potenciales 45 de cientos de células nerviosas), para la determinación de las respuestas farmacológicas y toxicológicas. Mediante el empleo de muchas redes en paralelo de un sistema robótico, automatizado, sería altamente deseable desarrollar un cribado altamente eficiente de compuestos que acelerara sustancialmente la investigación en estas áreas, y redujera drásticamente el número de animales requeridos por los actuales procedimientos de pruebas y evaluación. El tejido del sistema nervioso central procedente de los embriones de un ratón gestante (generalmente 10 - 12) 50 puede producir una reserva de células que posibiliten la siembra de más de 1000 redes. Esto representa una eficiencia extraordinaria en la utilización del tejido.

PUBLICACIONES CITADAS

55

Gramowski, Schiffmann y Groos, “Cuantificación de los efectos neurotóxicos agudos de la trimeltiltina utilizando redes neuronales cultivadas sobre matrices de microelectrodos” [“Quantification of acute neurotoxic effects of trimethyltin, using neuronal networks cultured on microelectrode arrays”], Neuro Toxicology, 21: 331-42, 2000

60

Gross y Gopal, Propiedades histiotípicas emergentes de redes neuronales cultivadas. En: M.Taketani y M. Baudry (eds) Avances en Electrofisiología de Redes Utilizando Matrices de Electrodo [Emerging histotypic propoerties of cultured neuronal networks, En: M. Taketari and M. Baudry (eds) [Advances in Network Electrophysicology using MultiElectrode Arrays]. Springer], pp 193 - 214, 2006.

65

Gross y Pancrazio Biosensores de Redes Neuronales. En: Tecnología de Biosensores Inteligentes (G.K.

Nnopf y A.S. Bassi, eds) Taylor y Francis Publishers, CRC Pres pp 177 - 201, 2006. [Neuronal Network Biosensors, In: Smart Biosensor Technology (G.K. Knopf and A.S. Bassi, eds), Taylor and Francis Publishers, CRC Press pp 177 - 201, 2006.

Gross, Rieske, Kreutzberg y Meyer, “Un nuevo sistema multimicroelectrodo de matriz fija para la supervisión 5 a largo plazo de la actividad in vitro de una sola unidad extracelular” [Gross, Rieske, Kreutzberg and Meyer “A new fixed array multimicroelectrode system designed for Longterm monitoring of extracellular single unit neuronal activity in vitro”, Neurosci. Lett, 6: 101 - 05, 1977].

Gross, “Dinámica interna de redes aleatorias neuronales de mamíferos en cultivos” En: Posibilidades 10 Tecnológicas de las redes neuronales cultivadas” [“Internal dynamics of randomized mammalian neuronal networks in culture”, In: Enabling Technoogies for Cultured Neural Networks, Stenger and McKenna (Eds.). Academic Press, NY, pp 277 - 317, 1994

Gross, Harsch, Rhoades and Gopel, Olor, fármaco, y análisis de toxinas con redes neuronales in vitro”. 15 Registro de Matrices extracelulares de respuestas de redes” [“Odor drug, and toxin analysis with neuronal networks in vitro: extracellular array recording of network responses”, Biosensors and Bioelectronics, 12: 373 - 93, 1997].

Keefer, Gramowski y Gross “Receptor de NMDA dependiente de oscilaciones periódicas en redes de la 20 columna vertebral cultivadas” [Keefer, Gramowski and Gross “NMDA receptor dependent periodic oscillations in cultured spinal cord networks”, J. Neurophysiol., 86: 3030 - 3042, 2001a].

Keefer, Gramowski, Stenger, Pancrazio y Gross, “Caracterización de los efectos neurotóxicos agudos del fosfato de metilolpropano a través de biosensores de redes neuronales” [Keefer, Gramowski, Stenger, 25 Pancrazio and Gross “Characterization of acute neurotoxic effects of trimethylolpropane phosphate via neuronal network biosensors”, Biosensors and Bioelectronics 16: 513 - 52, 2001b].

Morefield et al., “Evaluación de fármacos utilizando redes neuronales cultivadas sobre matrices de microelectrodos” [Morefield et al., “Drug evaluation using neuronal networks cultured on microelectrode 30 arrays, “Biosensors and Bioelectronics 15: 383 - 396, 2000].

Claverol - Timturé et al., “Matrices de multielectrodos con superposiciones microestructuradas elastoméricas para registros extracelulares a partir de neuronas moduladas”...

1. Una placa (10) de análisis de red neuronal que comprende:

una pluralidad de pocillos de registro (20) organizada en una pluralidad de filas de registro, en la 5 que cada pocillo de registro contiene una red de células neuronales (22) y una pluralidad de electrodos para registrar señales de potenciales de acción procedentes de la red de células neuronales;

una pluralidad de pocillos (30) de amplificación organizada en una pluralidad de filas de 10 amplificación, en la que cada pocillo de amplificación comprende uno o más amplificadores (32) para amplificar las señales de registro procedentes de los pocillos de registro, en la que la pluralidad de filas de registro y la pluralidad de filas de amplificación están alternadas, de manera que cada pocillo de registro está en posición adyacente a un pocillo de amplificación correspondiente; y 15

una pluralidad de interconexiones (25), en la que cada interconexión conecta los electrodos de un pocillo de registro con los amplificadores de un pocillo de amplificación correspondiente.

2. La placa de análisis de red neuronal de la reivindicación 1, en la que la pluralidad de pocillos de registro 20 comprende 48 pocillos de registro organizados en 6 filas de registro, y en la que la pluralidad de pocillos de amplificación comprende 48 pocillos de amplificación organizados en 6 filas de amplificación.

3. La placa de análisis de red neuronal de la reivindicación 2, en la que la placa de análisis de la red 25 neuronal utiliza los pocillos de una placa estándar de 96 pocillos con 12 filas de 8 pocillos cada una.

4. La placa de análisis de red neuronal de la reivindicación 1, en la que la pluralidad de pocillos de registro comprende 16 pocillos de registro organizados en 4 filas de registro, y en la que la pluralidad de pocillos de amplificación comprende 8 pocillos de amplificación organizados en 2 filas de amplificación. 30

5. La placa de análisis de red neuronal de la reivindicación 4, en la que la placa de análisis de la red neuronal utiliza los pocillos de una placa estándar de 24 pocillos con 6 filas de 4 pocillos cada una.

6. La placa de análisis de red neuronal de la reivindicación 1, que comprende así mismo una pluralidad de 35 barras de distribución (35) en contacto con los amplificadores existentes en los pocillos de amplificación.

7. La placa de análisis de red neuronal de la reivindicación 6, en el que las barras de distribución están conectadas a unos conectores (40), y en la que los conectores están conectados a un equipamiento de 40 amplificación secundario.

8. Un sistema robótico de manipulación de líquidos que comprende una placa de análisis de red neuronal de la reivindicación 1.

45

9. Un procedimiento para el registro paralelo, no multiplexado, de señales de potenciales de acción procedentes de redes de células nerviosas activas expuestas a uno o más agentes, que comprende:

la preparación de la placa de análisis de red neuronal de las reivindicaciones 1 o 7;

50

la exposición de los pocillos de registro de la placa de análisis de red neuronal a los uno o más agentes; y

el registro de las señales amplificadas por los pocillos de amplificación de la placa de análisis de red neuronal. 55

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el uno o más agentes son uno o más gentes farmacológicos.

11. Un procedimiento para la detección y cuantificación de respuestas farmacológicas y toxicológicas de 60 células neuronales sobre uno o más agentes in vitro, que comprende:

la preparación de la placa de análisis de red neuronal de las reivindicaciones 1 o 7;

la exposición de los pocillos de registro de la placa de análisis de red neuronal a los uno o más 65 agentes; y

el registro de las señales amplificadas por los pocillos de amplificación de la placa de análisis de red neuronal.

12. EL procedimiento de la reivindicación 11, en el que los uno o más agentes son uno o más agentes farmacológicos. 5

13. EL procedimiento de la reivindicación 11, que comprende así mismo la etapa de análisis de las señales registradas para cuantificar las respuestas farmacológicas y toxicológicas de las células neuronales a los uno o más agentes.