PROCEDIMIENTO DE CRIBADO IN VIVO DE AGENTES TÓXICOS CARDIACOS USANDO TELEÓSTEOS.

Procedimiento de cribado in vivo de agentes tóxicos cardiacos usando teleósteos Campo técnico La presente invención se refiere a un procedimiento de cribado de agentes para detectar cardiotoxicidad en base a las observaciones de la alteración de la frecuencia cardiaca y el ritmo cardiaco, usando embriones y larvas de teleósteos. Antecedentes - Campo de la invención La arritmia cardiaca, un grupo de afecciones en las que el corazón late demasiado rápido (taquirritmia), demasiado lento o de forma irregular (bradirritmia), es una emergencia médica potencialmente letal que causa paro cardiaco y muerte súbita. Las causas comunes para arritmia cardiaca tanto congénita como adquirida son perturbaciones del ritmo cardiaco genéticas e inducidas químicamente/por una enfermedad. Más de 50 compuestos terapéuticos han mostrado potencial para inducir una arritmia cardiaca inesperada y algunos de ellos fueron retirados del mercado. La arritmia cardiaca está considerada, actualmente, como un factor de riesgo significativo para predecir la seguridad en el ser humano de nuevos compuestos terapéuticos. Por lo tanto, las autoridades reguladoras de fármacos actualmente están más preocupadas por el potencial arrítmico de los compuestos terapéuticos y se han emitido consejos sobre regulación acerca de la evaluación del fomento de la arritmia. Conocimientos previos y descripción de la técnica anterior La base electrofisiológica celular de la arritmia cardiaca se debe al bloqueo de los canales iónicos, que da como resultado el retardo de la repolarización y la prolongación del intervalo QT, características de ECG con un intervalo más largo entre los puntos Q y T. Dado que éste es el objetivo de la mayoría de los fármacos no cardiacos que causan arritmia cardiaca, se presta especial atención al hERG (gen relacionado con ether-a-go-go humano) que codifica la subunidad formadora de poros del canal de potasio rectificador retardado de activación rápida. El canal es responsable de la corriente repolarizadora de potasio que se distingue de otra corriente por una fuerte rectificación hacia el interior. La inhibición de este canal, mediante compuestos exógenos o debido a una mutación genética, aumenta la duración de la repolarización del potencial de acción en miocitos cardiacos, dando como resultado arritmias cardiacas. No obstante, la arritmia cardiaca no se debe solamente al mal funcionamiento del hERG sino también de otros canales iónicos, tales como los canales de sodio y los canales de calcio. Por lo tanto, se hace hincapié en el cribado preclínico de nuevos compuestos terapéuticos con cualesquiera efectos tóxicos cardiacos inesperados mediante modelos experimentales altamente sensibles y específicos. Tradicionalmente, la electrofisiología de fijación de voltaje en microáreas de membrana se contempla como el procedimiento de referencia para medir la actividad del canal iónico. La técnica de fijación de voltaje en microáreas de membrana permite monitorizar directamente y en tiempo real la actividad del canal iónico en la administración de compuestos de ensayo en modelo de célula completa. Sin embargo, es una metodología de bajo rendimiento y requiere operadores altamente especializados. Aunque recientemente se han desarrollado otras tecnologías de cribado avanzadas para mejorar el grado de rendimiento, todas estas tecnologías se basan en modelos de cultivo celular in vitro. La desventaja de usar un modelo in vitro es que el complejo entorno fisiológico que se produce in vivo no puede reproducirse en un modelo en un sistema in vitro. Algunas cuestiones biológicas de la electrofisiología cardiaca simplemente no pueden abordarse mediante ensayos in vitro. En este caso, se han aplicado los modelos in vivo, incluyendo en cobaya, perro y primate. El ECG se registra continuamente en un intervalo de dosis en aumento en un animal anestesiado para detectar la aparición de cualquier arritmia cardiaca. Además, estos modelos no se usan ampliamente debido a los dilemas éticos y la rentabilidad. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar una nueva tecnología con un menor coste y una mayor eficacia. El pez cebra ha surgido como modelo en estudios de biología del desarrollo, estudios toxicológicos así como estudios farmacéuticos. El ensayo biológico con pez cebra in vivo combina las ventajas de alto rendimiento, en comparación con ensayos in vivo en mamíferos, y alta relevancia, en comparación con ensayos in vitro. Recientemente, se han publicado 2 artículos que demuestran las similares respuestas fisiológicas del pez cebra a compuestos bien conocidos que inducen arritmia cardiaca en el ser humano. Además, el ortólogo de hERG se clonó y mostró una gran similitud en la secuencia de proteínas en la región del poro y la región de unión al nucleótido cíclico a la que se unen algunos compuestos con toxicidad cardiaca. Además, la mutación en zERG muestra un fenotipo similar de arritmia cardiaca al del ser humano. Estos resultados sugieren que el pez cebra puede usarse como modelo para cribar compuestos con toxicidad cardiaca. Se han desarrollado procedimientos para medir la función cardiaca en el pez cebra. Sin embargo, estos son habitualmente de bajo rendimiento, consumen mucho tiempo y requieren un trabajo intensivo. El procedimiento más sencillo es usar un cronómetro para contar el número de latidos del corazón por minuto con un microscopio óptico convencional o un estereomicroscopio. Se ha desarrollado un procedimiento de análisis de imágenes de una película digital del corazón. Se midió la intensidad de píxel promedio de una región particular del corazón. Se realizó la transformada rápida de Fourier de estos datos para determinar la frecuencia cardiaca. Además de la frecuencia cardiaca, se han desarrollado otros parámetros cardiacos, por ejemplo gasto cardiaco, hemodinámica y propiedades 2   eléctricas. El gasto cardiaco, un importante parámetro de la fisiología cardiaca, puede determinarse de forma no invasiva en embriones transparentes de pez cebra mediante el cálculo del volumen ventricular durante el ciclo cardiaco filmando los latidos del ventrículo. La fórmula de cálculo del volumen requiere la longitud de los ejes del ventrículo que puede obtenerse perfilando el ventrículo de forma manual o automática con ayuda de un programa informático. La hemodinámica, según se determina mediante la presión sanguínea, puede medirse usando un sistema de micropresión de tipo servo-. En el sistema, un capilar de vidrio lleno de solución de NaCl de alta concentración se inserta en los vasos sanguíneos de interés usando un micromanipulador. El cambio de presión en el vaso sanguíneo desplazará la interfaz entre el plasma y la solución de NaCl, dando como resultado el cambio de resistencia eléctrica del electrodo en el interior del capilar de vidrio. Recientemente, se ha desarrollado una metodología para medir propiedades eléctricas en embriones de pez cebra. En la metodología, embriones de 5 días de edad se montan sobre su orientación dorso-ventral y se colocan 2 electrodos usando un micromanipulador, uno sobre la superficie del cuerpo fuera del corazón y otro electrodo de referencia en la solución circundante. Sin embargo, estos procedimientos también requieren mucho tiempo y un trabajo intensivo, particularmente en las etapas de preparación de muestras, lo que les hace inadecuados para un estudio de alto rendimiento. Schwerte Thorsten et al, (Development of the sympatho-vagal balance in the cardiovascular system in zebrafish (Danio rerio) characterized by power spectrum and classical signal analysis Journal of Experimental Biology, vol. 209, no. 6, marzo de2006 (03/2006), páginas 1093-1100, XP002557439 ISSN: 0022-0949) divulga un procedimiento de determinación de si un agente de ensayo causa cambios tanto en la frecuencia cardiaca absoluta (figura 2) como en la variabilidad de la frecuencia cardiaca (es decir el ritmo de la frecuencia cardiaca) (figura 5) que comprende las etapas: a) poner en contacto al pez cebra con un agente de ensayo; b) medir el ritmo cardiaco y su variabilidad grabando en video los corazones de pez cebra al microscopio y procesando las imágenes resultantes (p. 1094, col. 2). Sin embargo, este procedimiento se centra en el video del corazón en lugar de en el de la circulación de células sanguíneas. Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar un procedimiento de cribado de agentes en busca de la capacidad de interferir en la frecuencia cardiaca y la regularidad del ritmo cardiaco con mayor precisión y menor complejidad. Sumario de la invención La invención se refiere a un procedimiento que usa teleósteos como modelo para cribar un agente con cualquier efecto cardiotóxico, particularmente alteración de la frecuencia cardiaca y del ritmo cardiaco. Los teleósteos, embriones o larvas, se bañan... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de cribado de agentes con capacidad para alterar la frecuencia cardiaca y la regularidad del ritmo cardiaco, que comprende: a. Incubar un embrión o larva transparente de un teleósteo en un medio que contiene un agente de ensayo; b. Opcionalmente, inmovilizar dicho embrión o larva sobre una superficie; c. Grabar en video la circulación de células sanguíneas de dicho embrión o larva en un microscopio equipado con una cámara conectada a un dispositivo de grabación; d. Analizar el video con software de análisis de imágenes en el que las células sanguíneas en movimiento en cada fotograma de video son detectadas y cuantificadas, para obtener una serie de puntos de datos de cada fotograma de video de una parte del video o de todo el video; e. Aplicar análisis espectral de potencia para analizar la serie de puntos de datos, para obtener una frecuencia cardiaca y un índice de ritmicidad cardiaca. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho embrión o larva es de pez cebra o de medaka. 3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2 en el que la etapa (a) comprende la incubación de huevos fertilizados de teleósteos iniciada al menos a partir de 2 días después de la fertilización. 4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho embrión o larva en la etapa (a) se incuba durante al menos 4 horas. 5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la etapa (b) comprende la inmovilización de embriones o larvas de teleósteos en un medio de inmovilización seleccionado entre el grupo que consiste en agarosa, agar y metilcelulosa. 6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la filmación de la circulación de células sanguíneas de la etapa (c) se realiza durante al menos 20 segundos. 7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la parte de la película de la etapa (d) comprende la parte final de la película. 8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el procedimiento de análisis de video es capaz de cuantificar la velocidad de las células sanguíneas calculando la distancia que recorrieron las células sanguíneas durante el intervalo de tiempo analizado. 9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la frecuencia cardiaca de la etapa (e) se obtiene calculando el intervalo de tiempo entre los dos valores máximos continuos de la velocidad de las células sanguíneas. 10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el índice de ritmicidad cardiaca de la etapa (e) se obtiene comparando los intervalos de tiempo determinados mediante análisis espectral de potencia. 7   8   9     11   12