Una célula aislada que comprende:

a)un sustrato de Toxina Clostridial asociado a membrana,

comprendiendo dicho sustrato

i)un primer miembro de un par de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET);

ii)una secuencia de reconocimiento de Toxina Clostridial que incluye un sitio de escisión de Toxina Clostridial; y

iii)un dominio de dirección de membrana;

b)un segundo miembro asociado a membrana de un par de FRET, en el que el segundo par del miembro de FRET es un colorante lipófilo; y

c)un receptor que se une a una Toxina Clostridial;

en el que la célula es capaz de intoxicación por Toxina Clostridial;

en el que el par de FRET comprende un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que se superpone con el espectro de emisión de un fluoróforo donante; y

en el que en las condiciones apropiadas, la transferencia de energía de resonancia se muestra entre el aceptor y el fluoróforo donante

Ensayos de FRET a base de colorantes lipófilos para determinar la actividad de la toxina clostridial.

Todos los listados de secuencia del GenBank citados en esta solicitud, como identificados por sus números de acceso del GenBank, están disponibles a partir del Centro Nacional Para Información Biotecnológica.

Las propiedades miorrelajantes de las toxinas clostridiales (CoNTs) se están explotando en una amplia diversidad de aplicaciones terapéuticas y cosméticas, véase, por ejemplo William J. Lipham, COSMETIC AND CLINICAL APPLICATIONS OF BOTULINUM TOXIN (Slack, Inc., 2004). Por ejemplo, las terapias con CoNTs se proponen para tratamiento de distonía, véase, por ejemplo, Kei Roger Aoki, et al., Method for treating Dystonia with Botulinum Toxin C to G, Patente de Estados Unidos Nº 6.319.505 (20 de noviembre de 2001); dolor véase, por ejemplo, Kei Roger Aoki, et al., Method for Treating Pain by Peripheral Administration of a Neurotoxin, Patente de Estados Unidos Nº 6.464.986 (15 de octubre de 2002); lesiones musculares, véase, por ejemplo, Gregory F. Brooks, Methods for Treating Muscle Injuries, Patente de Estados Unidos Nº 6.423.319 (23 de julio de 2002); enfermedades cardiovasculares, véase, por ejemplo, Gregory F. Brooks, Methods for Treating Cardiovascular Diseases with Botulinum Toxins, Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 2003/0185860 (2 de octubre de 2003); trastornos neuropsiquiátricos, véase, por ejemplo, Steven Donovan, Therapeutic Treatrments for Neuropsychiatric Disorders, Patente de Estados Unidos Nº 2003/0211121 (13 de noviembre de 2003); dolor de la espalda inferior, véase por ejemplo, Kei Roger Aoki, et al., Botulinum Toxin Therapy for Lower Back Pain, Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 2004/0037852 (26 de febrero de 2004); así como otros trastornos neuromusculares, véase por ejemplo, Kei Roger Aoki, et al., Multiple Botulinum Toxins for Treating Neuromuscular Disorders and Conditions, Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 2001/0021695 (13 de septiembre de 2001); Kei Roger Aoki, et al., Tratamiento of Neuromuscular Disorders and Conditions with Different Botulinum, Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 2002/0010138 (24 de enero de 2002); Kei Roger Aoki, et al., Use of Botulinum Toxins for Treating Various Disorders and Conditions and Associated Pain, Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 2004/0013692 (22 de enero de 2004) todos los cuales se incorporan en el presente documento por referencia. Los usos propuestos adicionales de CoNTs como neuromoduladores biofarmacéuticos se ha ampliado hasta cubrir una amplia diversidad de tratamientos que se dirigen a ciertos trastornos que carecen de una base neuromuscular. Por ejemplo, los efectos sobre el sistema nervioso autónomo ha permitido el desarrollo de una terapia de serotipo A de toxina de Botulinum (BoNT/A) para tratar hiperhidrosis axilar o sudoración, y los informes indican que BoNT/A puede ser un tratamiento eficaz para el dolor y tensión miofacial, apoplejía, lesión traumática del cerebro, parálisis cerebral, trastornos de motilidad gastrointestinal, cáncer de incontinencia urinaria y dolores de cabeza de migraña. Por último, aplicaciones cosméticas y otras terapéuticas se conocen ampliamente. De hecho, el uso esperado de CoNTs en tratamientos tanto terapéuticos como cosméticos de seres humanos se previo para ampliar un intervalo siempre más amplio de enfermedades y alimentos que se pueden beneficiar de las propiedades miorrelajantes de estas toxinas.

El documento WO 2004/029576 desvela procedimientos basados en sustrato y células que usan un sustrato a base de FRET en los que los fluoróforos del donante y receptor están unidos a cualquier lado del sitio de escisión de la Toxina Clostridial.

Usando estos sustratos, el procedimiento desvelado basado en células puede detectar cantidades nM de toxina Clostridial. Además la optimización no mejoró ni la sensibilidad (CE₅₀) ni la señal al ruido. Por lo tanto se concluyó que este planteamiento no era capaz de detectar cantidades pM de toxina como se necesita para desarrollar un ensayo que pueda medir la actividad de BoNT/A en un vial de producto formulado.

El documento US 2006/0063222 desvela dos tipos de sustratos de toxina Clostridial. El primer tipo de sustrato comprende un único fluoróforo, un sitio de escisión de sustrato de Toxina Clostridial y un grupo voluminoso como una única molécula. El Segundo tipo de sustrato comprende un fluoróforo donante, un sitio de escisión del sustrato de la Toxina Clostridial y un aceptor como una única molécula. Los sustratos D2 deben tener tanto un fluoróforo como un grupo voluminoso. Ni el primer tipo de sustrato ni los procedimientos que usan este sustrato dependen de los principios de polarización de fluorescencia y no transferencia de energía de resonancia de Fluorescencia (FRET). Con relación al segundo tipo de sustrato, D2 no destruye la novedad de de los sustratos reivindicados actualmente debido a que deben tener dos fluoróforos.

El desarrollo del uso clínico y terapéutico de toxinas clostridiales necesita que la industria farmacéutica use ensayos precisos para determinar la actividad de la Toxina Clostridial con el fin de, por ejemplo, asegurar formulaciones farmacéuticas precisas y el control establecido de los patrones de control de calidad. Además, dado el potencial peligro asociado a las pequeñas cantidades de toxinas Clostridiales en productos alimenticios, la industria alimentaria requiere ensayos de Toxina Clostridial, por ejemplo, para validar nuevos procedimientos de envasado y para asegurar la seguridad de los alimentos. La presente invención proporciona ensayos de Toxina Clostridial novedosos para determinar la presencia o actividad de Toxina Clostridial útil para diversas industrias, tales como, por ejemplo, las industrias farmacéutica y alimentaria, así como ventajas asociadas.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 muestra un esquema de un ensayo FRET basado en colorantes lipófilos sobre líneas celulares que contiene un sustrato de Toxina Clostridial y un colorante lipófilo que se incorporan en las membranas celulares. Fig. 1a muestra un escenario de ensayo donde el sustrato de la Toxina Clostridial comprende el fluoróforo donante y se detecta la presencia de un sustrato de la Toxina Clostridial sin escindir. Tras la excitación, el donante de la proteína fluorescente emite luz fluorescente a una longitud de onda característica. Sin embargo, debido a que el sustrato sin escindir está localizado en la membrana, la proximidad cercana del donante de la proteína fluorescente y el aceptor del colorante lipófilo permite la transferencia de energía eficaz. La emisión de la proteína fluorescente excita el colorante lipófilo que a su vez emite luz fluorescente a su longitud de onda característica. La detección de las emisiones del colorante lipófilo es indicativa de FRET y la presencia de un sustrato de toxina Clostridial no escindido. Fig. 1b muestra un escenario de ensayo donde se detecta el sustrato de Toxina Clostridial que comprende el fluoróforo donante y la presencia de sustrato de toxina Clostridial escindido. Tras la excitación, el donante de proteína fluorescente emite luz fluorescente a una longitud de onda característica. Sin embargo, debido a que el producto de escisión de la proteína fluorescente del sustrato de Toxina Clostridial se libera en el citoplasma, la distancia entre el donante de proteína fluorescente y el aceptor del colorante lipófilo excede de la máxima distancia permitida para la transferencia de energía eficaz. De este modo, las emisiones de la proteína fluorescente no excitan el colorante lipófilo y FRET no se produce. Una disminución en las emisiones de colorante lipófilo es indicativo de una disminución de FRET, una disminución en el sustrato de Toxina Clostridial no escindido y, de manera inversa, un incremento en el sustrato de Toxina Clostridial escindido. Fig. 1c muestra un escenario de ensayo donde el colorante lipófilo que comprende el fluoróforo donante y la presencia de un sustrato de toxina Clostridial no escindido se detecta. Tras la excitación, el donante de colorante lipófilo emite luz fluorescente a una longitud de onda característica. Sin embargo, debido a que el sustrato de toxina Clostridial no escindido se localiza en la membrana, la proximidad cercana del donante de colorante lipófilo y el aceptor de la proteína fluorescente permite la transferencia de energía eficaz. La emisión del colorante lipófilo excita la proteína fluorescente que a su vez emite luz fluorescente a su longitud de onda característica. La detección de las emisiones de la proteína...

1. Una célula aislada que comprende:

en el que la célula es capaz de intoxicación por Toxina Clostridial;

en el que el par de FRET comprende un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que se superpone con el espectro de emisión de un fluoróforo donante; y

en el que en las condiciones apropiadas, la transferencia de energía de resonancia se muestra entre el aceptor y el fluoróforo donante.

2. La célula de la reivindicación 1, en la que la célula contiene de manera transitoria el sustrato de Toxina Clostridial.

3. La célula de la reivindicación 1, en la que la célula que contiene de manera estable el sustrato de Toxina Clostridial.

4. La célula de la reivindicación 1, en la que el sustrato de Toxina Clostridial se expresa a partir de una molécula de ácido nucleico.

5. La célula de la reivindicación 1, en la que la célula en una célula neuronal.

6. La célula de la reivindicación 1, en la que la célula en una célula no neuronal.

7. La célula de la reivindicación 1, en la que el primer miembro del par de FRET es una proteína fluorescente o una proteína de unión a fluoróforo.

8. La célula de la reivindicación 1, en la que el primer miembro del par FRET es el aceptor y el segundo miembro del par de FRET es el fluoróforo donante.

9. La célula de la reivindicación 1, en la que el primer miembro del par FRET es el fluoróforo donante y el segundo miembro del par FRET es el aceptor.

10. La célula de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial comprende una secuencia de reconocimiento de BoNT/A incluyendo un sitio de escisión de BoNT/A, una secuencia de reconocimiento de BoNT/B incluyendo un sitio de escisión BoNT/B, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 incluyendo un sitio de escisión de BoNT/C1, una secuencia de reconocimiento de BoNT/D incluyendo un sitio de escisión de BoNT/D, una secuencia de reconocimiento de BoNT/E incluyendo un sitio de escisión de BoNT/E, una secuencia de reconocimiento de BoNT/F incluyendo a BoNT/F sitio de escisión, a BoNT/G secuencia de reconocimiento incluyendo un sitio de escisión de BoNT/G, o una secuencia de reconocimiento de TeNT incluyendo un sitio de escisión de TeNT.

11. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial comprende al menos seis restos consecutivos de SNAP-25, comprendiendo los seis restos consecutivos Gln-Arg.

12. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial comprende al menos seis restos consecutivos de VAMP, comprendiendo los seis restos consecutivos Gln-Phe.

13. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial comprende al menos seis restos consecutivos de SNAP-25, comprendiendo los seis restos consecutivos Arg-Ala.

14. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial comprende al menos seis restos consecutivos de Sintaxina, comprendiendo los seis restos consecutivos Lys-Ala.

15. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial comprende al menos seis restos consecutivos de VAMP, comprendiendo los seis restos consecutivos Lys-Leu.

16. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial comprende al menos seis restos consecutivos de SNAP-25, comprendiendo los seis restos consecutivos Arg-Ile.

17. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial comprende al menos seis restos consecutivos de VAMP, comprendiendo los seis restos consecutivos Gln-Lys.

18. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de reconocimiento de la Toxina Clostridial comprende al menos seis restos consecutivos de VAMP, comprendiendo los seis restos consecutivos Ala-Ala.

19. La célula de la reivindicación 1, en el que el receptor es un receptor de Toxina Clostridial endógeno.

20. La célula de la reivindicación 1, en el que el receptor es un receptor de Toxina Clostridial exógeno.

21. Un procedimiento de determinación de la actividad de la Toxina Clostridial, que comprende

en el que una transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de la célula puesta en contacto comparado con la célula control es indicativo de la actividad de la Toxina Clostridial.

22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que la muestra es un lisado de células bruto, una Toxina Clostridial a granel, una Toxina Clostridial parcialmente purificada, una Toxina Clostridial purificada o un producto o de Toxina Clostridial formulado.

23. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que la muestra comprende un producto de Toxina Clostridial formulado.

24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que el producto de Toxina Clostridial formulado es un producto de BoNT/A formulado.

25. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que la muestra es un alimento crudo, un alimento parcialmente cocinado o procesado, un alimento cocinado o procesado, una bebida, un alimento animal, una muestra de suelo, una muestra de agua, o un sedimento de estanque.