ENSAYO DE CITOTOXICIDAD.
Un método para determinar la citotoxicidad de un agente a ensayar,
el método comprende:
(a) contacto de células vivas en medio de cultivo contenidas en una vasija, con una cantidad predeterminada de agente a ensayar; y
(b) incubado de células en el medio de cultivo del paso (a) durante una cantidad predeterminada de tiempo; después
(c) adición a las células y al medio de cultivo del paso (b) de un reactivo mezcla que no sea tóxico para las células vivas, donde el reactivo mezcla comprende:
un solvente, un colorante que tenga un estado oxidado y un estado reducido donde el estado reducido pueda ser distinguido del estado oxidado y donde el colorante esté inicialmente presente en el estado oxidado, un agente transferidor de electrones, un sustrato para la enzima citoplasmática que tenga una vida media mayor de dos horas, y un cofactor para la enzima citoplasmática; y después
(d) medida del medio de cultivo del paso (c) para la producción del estado reducido del colorante, siendo causada la producción del estado reducido del colorante por la enzima citoplasmática específica para el sustrato dentro del reactivo mezcla añadido en el paso (c), donde la enzima citoplasmática ha sido liberada de las células muertas y de las células moribundas dentro de la vasija, a través de la cual se determina la citotoxicidad del agente a ensayar
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US03/10872.
Solicitante: PROMEGA CORPORATION.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 2800 WOODS HOLLOW ROAD,MADISON, WISCONSIN 53711.
Inventor/es: MORAVEC,RICHARD,A, RISS,TERRY,L.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 9 de Junio de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- G01N33/50D2D
Clasificación PCT:
- C12N9/04 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre grupos CHOH como dadores, p. ej. glucosa oxidasa de glucosa, deshidrogenasa láctica (1.1).
- C12Q1/00 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones.
- C12Q1/02 C12Q […] › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen microorganismos vivos.
- C12Q1/04 C12Q 1/00 […] › Determinación de la presencia o del tipo de microorganismo; Empleo de medios selectivos para la investigación o análisis de antibióticos o bactericidas; Composiciones para este fin que contienen un indicador químico.
- C12Q1/26 C12Q 1/00 […] › en los que interviene una oxidorreductasa.
- C12Q1/32 C12Q 1/00 […] › una deshidrogenosa.
- G01N33/50 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
Clasificación antigua:
- C12N9/04 C12N 9/00 […] › actúan sobre grupos CHOH como dadores, p. ej. glucosa oxidasa de glucosa, deshidrogenasa láctica (1.1).
- C12Q1/00 C12Q […] › Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones.
- C12Q1/02 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen microorganismos vivos.
- C12Q1/04 C12Q 1/00 […] › Determinación de la presencia o del tipo de microorganismo; Empleo de medios selectivos para la investigación o análisis de antibióticos o bactericidas; Composiciones para este fin que contienen un indicador químico.
- C12Q1/26 C12Q 1/00 […] › en los que interviene una oxidorreductasa.
- C12Q1/32 C12Q 1/00 […] › una deshidrogenosa.
Fragmento de la descripción:
Ensayo de citotoxicidad.
Campo de la invención
Esta invención está dirigida a ensayos para la determinación del efecto citotóxico de un compuesto a ensayar dado o de unas determinadas condiciones de ensayo. El método inventivo mide la liberación de un componente citoplasmático proveniente de las células teñidas y muertas, teniendo el compuesto citoplasmático una vida media en el medio de cultivo mayor de dos horas, y preferiblemente mayor de cuatro horas a 37ºC. El componente citoplasmático se mide mediante la conversión de un colorante indicador. El componente citoplasmático preferido para ser medido es la enzima lactato deshidrogenasa (LDH), una enzima que cataliza la oxidación del lactato a piruvato. Por lo tanto, en la realización preferida, se liga una oxidación catalizada por la LDH a una reducción catalizada por la diaforasa de unas especies no-fluorescentes para rendir un fluoróforo. Se revelan también los kits para la práctica de la invención.
Antecedentes
Los métodos para determinar la citotoxicidad y la viabilidad celular en respuesta a la exposición de un agente a probar dado son la llave importante a pruebas farmacéuticas y medioambientales, pruebas de pesticidas y herbicidas, descubrimiento de medicamentos, etc. Concretando, para determinar si un determinado agente químico presenta un riesgo real o potencial cuando es expuesto a un determinado tipo de célula se requiere un método que fiel, precisa y exactamente mida la citotoxicidad y/o viabilidad celular tras la exposición al agente a ensayar.
Un método común de determinación de la viabilidad celular se basa en la habilidad de la membrana celular de las células viables para excluir colorantes vitales como el azul tripán y el yoduro de propidio. Las células vivas excluyen estos colorantes vitales y no se tiñen. Por el contrario, las células muertas y agonizantes han perdido la integridad de la membrana y permiten a estos colorantes entrar en el citoplasma, donde los colorantes tiñen compuestos y organelas dentro de la célula.
Las células no-viables que han perdido la integridad de la membrana también dejan escapar componentes citoplasmáticos al medio circundante. Así la muerte celular se puede medir mediante la monitorización de la concentración de estos compuestos celulares en el medio circundante. Un método tal se describe en Corey et al. (1997) J. Immunol. Meth. 207: 43-51. En este ensayo se mide la liberación de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH) a partir de células muertas o dañadas mediante el acoplamiento de la actividad de la G3PDH liberada a la producción de ATP.
Otros métodos para probar la viabilidad o la muerte celular dependen de la conversión de un colorante desde un estado a otro. Por ejemplo, en un formato típico, previo a la reacción, el colorante absorbe a una primera longitud de onda de radiación. El colorante se convierte después en un producto que absorbe a una segunda (y diferente) longitud de onda de luz. Mediante la monitorización de la conversión del colorante de un estado a otro se puede determinar el grado de viabilidad celular o de muerte celular. Para este propósito se muestran en este artículo un número de colorantes adecuados. De estos indicadores, los que se usan más frecuentemente son los colorantes aceptores de electrones como las sales de tetrazolio. Las sales de tetrazolio informadas en este artículo incluyen MMT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio), XTT (ácido (sodio 3'-{(1-fenilamino-carbonil)-3,4-tetrazolio}-bis(4-metoxi-6-nitro) bencenosulfónico hidrato) y, MTS (sal interna de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio).
Se ha descrito un ensayo típico de viabilidad celular y de proliferación usando MTS (Buttke et al., (1993) J. Immunol. Methods, 157: 233-240). Dunigan et al., (1995, BioThechniques, 19: 640-649) procede a describir que uno de los sellos del metabolismo es la generación de energía mediante complejas reacciones redox de moléculas orgánicas. Un gran número de estas reacciones utilizan ß-nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) o ß-nicotinamida adenina dinucleótidofosfato (NADPH) como donantes de hidrógeno. Mientras es teóricamente posible monitorizar directamente las concentraciones de NADH y NADPH mediante espectrofotometría, desde un punto de vista práctico, el análisis espectrofotométrico directo está limitado debido a la presencia de numerosos compuestos que absorben luz cerca del máximo de absorción del NADH y del NADPH (
Buttkle et al. describe, usando MTS para medir indirectamente la reducción causada por las células vivas proliferantes, el MTS teniendo una absorbancia en la región del visible cuando está en su forma reducida. La reducida, forma formazen del MTS, es soluble en agua y tiene un amplio máximo de absorción centrado a 450-580 nm. Los experimentos descritos por Dunigam et al. son enteramente libres de células. Las soluciones de MTS y MTS/fenazina metosulfato (PMS) se prepararon como soluciones madre y se añadieron distintas combinaciones de enzimas y agentes reductores a alícuotas de esta solución madre y se analizaron espectrofotométricamente a lo largo del tiempo. Se analizaron varias combinaciones de NADH, NADPH, ditiotreitol, 2-mercaptoetanol, ácido málico, ácido isocítrico, maleato deshidrogenasa y isocitrato deshidrogenasa. Los autores encontraron que el MTS sólo se convierte únicamente a su forma reducida de estructura formazen muy lentamente. La reactividad del MTS, en cambio, se acelera enormemente mediante la adición del reactivo transferidor de electrones PMS al 5% a la solución de reacción. De esta forma, los autores concluyen que el MTS/PMS es un monitor útil de la generación de NADH y NADPH en sistemas acuosos libres de células.
Lancaster et al., Nº de Patente U.S. 5.501.959, publicada el 26 de marzo de 1996, describe un ensayo de viabilidad y de proliferación en el que microorganismos, células tisulares, o similares, son incubados en medio de crecimiento en presencia del colorante resazurina y un compuesto a ser ensayado. Se añadió también a la mezcla de reacción un agente estabilizador redox, al que se le ha dado el nombre de agente "envenenante", con el fin de inhibir la autorreducción no-específica de la resazurina debido a los componentes encontrados dentro de la mayoría de los medios de cultivo. En este ensayo, el colorante resazurina es reducido por la actividad de las células vivas. Así, en el ensayo de Lancaster et al., el colorante resazurina se usa como un indicador redox para detectar el crecimiento microbiano, no la muerte microbiana. La forma reducida de la resazurina, conocida trivialmente como resorufina, puede ser detectada fluorimétricamente y colorimétricamente. La resazurina, la forma oxidada del colorante, es azul, mientras la resorufina, la forma reducida del colorante, es roja.
Se pueden adquirir comercialmente varios ensayos citotóxicos. Por ejemplo, Molecular Probes de Eugene, Oregon, comercializa un kit de ensayo de citotoxicidad bajo la marca registrada "Vybrant". El ensayo marca "Vybrant" detecta la liberación de la enzima citoplasmática glucosa-6-fosfato deshidrogenada (G6PDH) de las células muertas y moribundas. Este ensayo detecta G6PDH mediante un proceso en dos pasos que conduce a la reducción de la resazurina a resorufina. La literatura de los productos de Molecular Probes establece específicamente que las incubaciones no sean de más de 24 horas "provocaría una degradación significativa de la G6PDH, perjudicando los resultados del ensayo". Ver prospecto informativo del producto de Molecular Probes nº V-23111, revisado el 22 de Octubre de 2001. De todas formas, en manos de los inventores presentes, la vida media de la G6PDH seguido de la lisis celular a 37ºC se estimó ser menor de dos horas a 37ºC, por lo tanto, resultando este kit inapropiado para el ensayo citotóxico para mayores espacios de tiempo.
Promega Corporation de Madison, Wisconsin, vende una línea de ensayos de viabilidad celular, citotoxicidad y proliferación celular bajo las marcas registradas de "CellTiter 96", "CellTiter-Glo" y "CytoTox 96". Ver los boletines técnicos de Promega nºs 112 (publicado en 1991), 169 (publicado en Junio de 1993), 245 (publicado en Agosto de 1996), y 288 (publicado en Marzo de 2001).
La literatura de los productos "CytoTox 96, Ensayo citotóxico no-radioactivo" (boletín técnico...
Reivindicaciones:
1. Un método para determinar la citotoxicidad de un agente a ensayar, el método comprende:
2. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 1, donde en el paso (c), el estado reducido del colorante se pueda distinguir fluorimétricamente del estado oxidado del colorante, y en el paso (d), el medio de cultivo se mida para la producción del estado reducido del colorante mediante espectroscopía de fluorescencia.
3. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 1, donde en el paso (c), el estado reducido del colorante se pueda distinguir colorimétricamente del estado oxidado del colorante, y en el paso (d), el medio de cultivo se mida para la producción del estado reducido del colorante mediante espectroscopía en el visible.
4. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 1, donde en el paso (c), el colorante es la resazurina o la sal interna de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS).
5. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 1, donde en el paso (c), el agente transferidor de electrones es una enzima.
6. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 1, donde en el paso (c), el agente transferidor de electrones es la diaforasa.
7. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 1, donde en el paso (c), el sustrato es el lactato y el cofactor es el NAD+, y en el paso (d), la producción del estado reducido del colorante es causada por la lactato deshidrogenasa.
8. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 1, donde en el paso (a), la vasija contiene las células vivas que son procariotas.
9. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 1, donde en el paso (a), la vasija contiene las células vivas que son eucariotas.
10. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 1, donde en el paso (a), la vasija contiene las células vivas que son células eucariotas cultivadas.
11. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 1, donde en el paso (a), el agente a ensayar es un antibiótico conocido.
12. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 1, donde en el paso (a), el agente a ensayar es un agente farmacéutico o terapéutico conocido.
13. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 1, donde: en el paso (b) las células se incuban, en el paso (c) se añade el reactivo mezcla, y en el paso (d), se mide el medio de cultivo para la producción del estado reducido del colorante, todo en la vasija del paso (a).
14. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 1, donde en el paso (d), se mide el medio de cultivo para la producción del estado reducido del colorante sin separar el medio de cultivo de las células del paso (c).
15. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 1, donde en el paso (c), el solvente es un solvente acuoso.
16. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 1, donde en el paso (c), el solvente es un solvente tamponado.
17. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 1, donde el reactivo mezcla comprende un solvente acuoso, lactato, NAD+, diaforasa, tampón Tris, HEPES, NaCl y resazurina.
18. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 17, donde el reactivo mezcla comprende:
desde 50 mM hasta 250 mM de lactato;
desde 0,1 U/ml hasta 10 U/ml de diaforasa;
desde 0,5 mM hasta 10 mM de NAD+;
desde 1 mM hasta 10 mM de tampón Tris;
desde 10 mM hasta 100 mM de HEPES;
desde 1 mM hasta 100 mM de NaCl;
desde 50 µM hasta 500 µM de resazurina.
19. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 17, donde el reactivo mezcla comprende:
109 mM de lactato;
3,3 mM de NAD+;
2,2 U/ml de diaforasa;
3,0 mM de tampón Tris;
30 mM de HEPES;
10 mM de NaCl; y
350 µM de resazurina.
20. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 17, donde el reactivo mezcla tenga un pH desde 7,0 hasta 8,0.
21. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 17, donde el reactivo mezcla tenga un pH desde 7,25 hasta 7,6.
22. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 1, comprendiendo más allá el paso de añadir una solución de parada a la vasija, después del paso (c) y antes del paso (d).
23. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 22, donde la solución de parada comprende un jabón o un detergente.
24. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 22, donde la solución de parada comprende dodecilsulfato sódico.
25. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 22, donde la solución de parada comprende hidróxido sódico.
26. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 1, donde en el paso (c) el reactivo mezcla comprende un sustrato para la enzima citoplasmática que tiene una vida media mayor de dos horas seguido de la lisis celular o de la muerte celular a 37ºC.
27. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 1, donde en el paso (c) el reactivo mezcla comprende un sustrato para la enzima citoplasmática que tiene una vida media mayor de cuatro horas seguido de la lisis celular o de la muerte celular a 37ºC.
28. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 1, donde en el paso (c) el reactivo mezcla comprende un sustrato para la enzima citoplasmática que tiene una vida media mayor de seis horas seguido de la lisis celular o de la muerte celular a 37ºC.
29. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 1, donde en el paso (c) el reactivo mezcla comprende un sustrato para la enzima citoplasmática que tiene una vida media mayor de ocho horas seguido de la lisis celular o de la muerte celular a 37ºC.
30. Un método como se reivindicaba en cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde en el paso (a) se añade una cantidad predeterminada de agente a ensayar a la vasija conteniendo las células vivas en el medio de cultivo; y el reactivo mezcla comprende:
un solvente acuoso, resazurina, un agente transferidor de electrones, NAD+, y lactato; y el paso (d) comprende la medida del medio de cultivo del paso (c) para la producción de resorufina sin extraer el medio de cultivo del vaso, siendo la producción de resorufina causada por la liberación de la lactato deshidrogenasa a partir de las células muertas y moribundas dentro del vaso, a través del cual es determinada la citotoxicidad del agente a ensayar.
31. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 30, donde en el paso (c), el agente transferidor de electrones es el azul de Meldola.
32. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 30, donde en el paso (a), el agente a ensayar es un compuesto tóxico conocido o teórico.
33. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 30, donde en el paso (d), la producción de resorufina se mide fluorimétricamente.
34. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 30, donde en el paso (d), la producción de resorufina se mide colorimétricamente.
35. Un método como se reivindicaba en la reivindicación 30, donde el reactivo mezcla comprende un solvente acuoso, lactato, NAD+, diaforasa, tampón Tris, HEPES, NaCl y resazurina.
36. Un kit para la medida de la citotoxicidad de un agente a ensayar, el kit comprende, en combinación:
un colorante dispuesto en un primer contenedor, el colorante teniendo un estado oxidado y un estado reducido donde el estado reducido se puede distinguir del estado oxidado y donde el colorante está presente en el estado oxidado, es decir estando el colorante de resazurina desde 50 µM hasta 500 µM, donde la resazurina está dispuesta en una mezcla de reactivo premezclada lista para usar que no es tóxica para las células vivas, el reactivo mezcla comprendiendo desde 0,1 U/ml hasta 10 U/ml de diaforasa, desde 50 mM hasta 250 mM de lactato, desde 0,5 mM hasta 10 mM de NAD+, desde 1 mM hasta 10 mM de tampón fosfato, desde 10 mM hasta 100 mM de HEPES, y desde 1 mM hasta 100 mM de NaCl; dicha mezcla de sustrato teniendo un pH desde 7,0 hasta 8,0 en solución, y
instrucciones para usar el kit.
37. Un kit como se reivindicaba en la reivindicación 36, donde el estado reducido del colorante se puede distinguir del estado oxidado del colorante fluorimétricamente o colorimétricamente.
38. Un kit como se reivindicaba en la reivindicación 36, donde el reactivo mezcla comprende una solución acuosa comprendiendo:
109 mM de lactato;
3,3 mM de NAD+;
2,2 U/ml de diaforasa;
3,0 mM de tampón Tris;
30 mM de HEPES;
10 mM de NaCl; y
350 µM de resazurina.
39. Un kit como se reivindicaba en la reivindicación 36, donde el reactivo mezcla tenga un pH desde 7,25 hasta 7,60.
40. Un kit como se reivindicaba en la reivindicación 36, comprendiendo más allá una solución de parada dispuesta en un segundo contenedor.
41. Un kit como se reivindicaba en la reivindicación 36, donde la solución de parada comprende un jabón o un detergente.
42. Un kit como se reivindicaba en la reivindicación 36, donde la solución de parada comprende dodecilsulfato sódico.
43. Un kit como se reivindicaba en la reivindicación 36, donde la solución de parada comprende hidróxido sódico.
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