Un procedimiento para almacenar ADN en forma de complejo de quitosano/ADN preparado mezclando una disolución de ADN y una disolución de quitosano hidrosoluble,

en el que el ADN es ADN genómico de animales, plantas, hongos, bacterias y virus, y el quitosano hidrosoluble tiene un grado de desacetilación del 60% o superior, y un peso molecular de 10 kDa a 500 kDa

Procedimiento para almacenar ADN usando quitosano, y productos que utilizan los procedimientos.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para almacenar ADN, un procedimiento para analizar el ADN almacenado por el procedimiento anteriormente mencionado y a productos que utilizan los procedimientos. Más concretamente, la invención se refiere a un procedimiento para almacenar ADN en un estado estabilizado a temperatura ambiente durante un tiempo prolongado, a un procedimiento para analizar el ADN almacenado por el procedimiento mencionado anteriormente y a una tarjeta de ID de ADN, tal como una tarjeta de ADN, fabricada de papel o una tarjeta de ADN fabricada de plástico, que se producen usando los procedimientos de almacenamiento y análisis anteriormente mencionados.

Técnica anterior

La suma de todos los genes presentes en los organismos se denomina genomas. Se ha informado que el genoma humano está compuesto por 3 mil millones de bases y que tiene aproximadamente 30.000 genes. Recientemente, se ha completado el proyecto genoma humano, desarrollado para decodificar las secuencias de bases de todo el genoma humano, permitiendo de este modo acceder a trascendentales mejoras en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades refractarias a los tratamientos, usando genes. Por así decirlo, ha comenzado la era de la medicina personalizada y de las medicina predictiva.

Los fenómenos de la vida están determinados por tres cuestiones: (1) la información genética del ADN genómico, (2) la transcripción de los genes y (3) las proteínas expresadas. Para entender y analizar los fenómenos de la vida, y para desarrollar procedimientos para diagnosticar y tratar enfermedades, es importante analizar con precisión las tres cuestiones anteriormente mencionadas. La suma de genes de un individuo se denomina genes o genomas y, por consiguiente, la suma de los genes transcritos (es decir, el ADNm) y la suma de las proteínas expresadas en un individuo se denominan transcriptoma y proteoma, respectivamente. Recientemente, los estudios sobre análisis automatizados de tal información integral progresan de manera activa. Para la automatización de los análisis, resulta útil una micromatriz o un biochip en particular, y los ejemplos representativos de los mismos incluyen un chip de ADN y un chip de proteínas.

Como procedimientos generales para el análisis cualitativo y cuantitativo de la información genética del ADN genómico, pueden mencionarse el análisis de hibridación, el análisis de secuenciación, las micromatrices o chips de ADN, o similares, por medio de PCR, PCR-RFLP (PCR de Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción), clonación y producción de bibliotecas, transferencia southern o similares (Sambrook, J. & Russell, D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (2001)).

Cuando se analiza el ADN de una persona, es posible comprender la salud de la persona y dar un diagnóstico de si la persona contrajo diversas enfermedades tales como cáncer o infecciones, así como predecir la posibilidad de que en el futuro presente brotes de enfermedades genéticas y la transmisión a los hijos de dicha persona. Además, el análisis de ADN es el modo más exacto para probar la identidad y el parentesco de una persona, tal como la paternidad. También resulta útil para demostrar líneas o árboles genealógicos. Por esa razón, el análisis de ADN se ha utilizado de manera inevitable como medio en la medicina forense y para discriminar la idoneidad en la donación de médula ósea, otros órganos internos o similares. Además, el análisis de polimorfismos de nucleótido único (SNP) puede ayudar a predecir la posibilidad que se presenten en el futuro brotes de enfermedades, reacciones a fármacos o similares.

Cuando se reconoció la necesidad de almacenar el ADN para pruebas de ADN futuras, cada país ha establecido fácilmente bancos de ADN, y el número de muestras en el banco de ADN tiende a aumentar en gran parte debido a el almacenamiento de ADN relacionado con los seguros de viajes o seguros de accidentes, almacenamiento del ADN de las fuerzas armadas de EEUU o similares. Sin embargo, el almacenamiento del ADN personal en una organización nacional o en una organización comercial, puede tener un problema tal como el uso inadecuado de la información genética personal. Por otra parte, para almacenar el ADN de manera segura durante un tiempo prolongado por medio de la tecnología existente, se necesitan congeladores y reactivos específicos y, por consiguiente, el coste para almacenar el ADN es importante.

De hecho, cuando el ADN separado y purificado a partir de una célula se deja en reposo a temperatura ambiente, puede presentarse el problema de la rápida degradación del ADN o la segmentación por desoxirribonucleasa (DNAsa). Por consiguiente, resulta importante un procedimiento para almacenar ADN para estudios de genes. Actualmente, como procedimientos para almacenar o transportar ADN, que se utilizan ampliamente, pueden mencionarse un procedimiento para almacenar ADN en estado líquido purificando el ADN separado del fluido corporal tal como sangre, células o tejidos; un procedimiento de almacenamiento en un congelador; un procedimiento de almacenamiento mediante liofilización; un procedimiento de almacenamiento en alcohol 2-propílico; y similares (por ejemplo, Madisen y col., J. Med. Genetics, 27(2), 1987, páginas. 379-390). Sin embargo, en estos procedimientos hay muchas desventajas desde el punto de vista de costes y de pérdidas. El procedimiento para almacenar el ADN purificado en estado líquido resulta fácil para usar el ADN inmediatamente, pero existe el problema de que el ADN se daña fácilmente cuando se almacena durante un tiempo prolongado. El procedimiento para almacenar en un congelador y el procedimiento de liofilización tienen el problema de que el ADN puede dañarse por la repetida congelación y descongelación en el proceso de utilización de la muestra. Además, el procedimiento de almacenamiento usando un reactivo tal como alcohol también resulta problemático en el proceso de pretratamiento y postratamiento, así como otros procedimientos. Por otra parte, el problema más importante en los procedimientos anteriores es que el ADN debe purificarse primero del fluido corporal, tal como sangre, para el almacenamiento.

Los procedimientos descritos anteriormente para almacenar el ADN requieren equipamientos especiales, costosos, tales como congeladores de temperatura ultra baja, nitrógeno líquido, y similares. Por consiguiente, no resultan ventajosos porque los procedimientos pueden imponer una carga desde el punto de vista económico, los procedimientos requieren procesos de pretratamiento y postratamiento cuando se reutiliza el ADN almacenado para el análisis, y el procedimiento podría dañar el ADN por los repetidos procesos de congelación y descongelación.

Además de los procedimientos mencionados anteriormente, se introducen varios productos comercializados tales como una tarjeta FTA o una tarjeta fabricada por Whatman plc., y similares, con el fin de almacenar ADN de plásmido a temperatura ambiente (por ejemplo, documento US-A-5985327 publicado el 16 de noviembre de 1999). Sin embargo, este procedimiento tiene limitaciones en cuanto a su eficacia, y se sugiere almacenar el ADN a -15ºC o a -20ºC en lugar de a temperatura ambiente, por consiguiente no hay una gran ventaja sobre los procedimientos originales, más bien resulta bastante desfavorable en lo que respecta al aumento de costes.

Por consiguiente, es un objeto importante en el campo de la genética molecular y la medicina desarrollar un posible procedimiento para proteger el ADN de la descomposición por desoxirribonucleasas por medio de la formación de un enlace estable con el ADN, almacenar el ADN en un estado estabilizado a temperatura ambiente, y además para aplicar directamente a los estudios y análisis que usan ADN. Los procedimientos de almacenamiento ideales deben incluir: (1) un procedimiento para almacenar de manera estable a temperatura ambiente sin que se produzca degradación del ADN; (2) un procedimiento que sea simple; (3) un procedimiento que sea rentable; (4) el almacenamiento del ADN no debe ser sólo para el mismo ADN separado y purificado, sino también para muestras que contienen fluido corporal, tal como sangre y ADN diversos, que no tengan daños en el ADN; (5) diversas muestras de ADN deben almacenarse en un espacio limitado; (6) un individuo debe poder almacenar su ADN personal; y (7) no debe haber ningún problema en los análisis de los diversos genes...

1. Un procedimiento para almacenar ADN en forma de complejo de quitosano/ADN preparado mezclando una disolución de ADN y una disolución de quitosano hidrosoluble, en el que el ADN es ADN genómico de animales, plantas, hongos, bacterias y virus, y el quitosano hidrosoluble tiene un grado de desacetilación del 60% o superior, y un peso molecular de 10 kDa a 500 kDa.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la concentración de una disolución acuosa de quitosano hidrosoluble es del 0,02% (p/v) al 1% (p/v) y la relación de pesos del quitosano hidrosoluble al ADN en la mezcla es de 1:0,5 o superior.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la concentración de una disolución acuosa de quitosano hidrosoluble es del 0,02% (p/v) al 0,25% (p/v), la concentración de una disolución de ADN es de 1 μg/μl o inferior, y la relación de pesos del quitosano hidrosoluble al ADN en la mezcla es de 1:0,5 a 1:3.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el complejo del ADN y el quitosano se almacena a temperaturas desde -70ºC hasta temperatura ambiente.

5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el complejo de ADN unido a quitosano se almacena en estado líquido.

6. Una tarjeta de ADN de tipo papel para almacenar ADN, en la que la tarjeta de ADN se prepara por inmersión en una composición que comprende quitosano hidrosoluble y ácido úrico y por secado, y el ADN se conserva goteando una disolución de ADN sobre la tarjeta a medida que el ADN se une con el quitosano hidrosoluble, y el ADN es ADN genómico de animales, plantas, hongos, bacterias o virus.

7. Una tarjeta de ADN de tipo papel para almacenar ADN, en la que la tarjeta de ADN se prepara por inmersión en una composición que comprende quitosano hidrosoluble y un tampón de lisis celular que contiene ácido úrico y por secado, y el ADN se almacena goteando muestra biológica que contiene ADN genómico sobre la tarjeta a medida que el ADN se une con el quitosano hidrosoluble.

8. La tarjeta de ADN de tipo papel según la reivindicación 6 ó 7, en la que el papel es para transferencia o cromatografía y el espesor del mismo es de 0,3 a 1,2 mm.

9. La tarjeta de ADN de tipo papel según la reivindicación 6 ó 7, en la que la tarjeta está marcada con 6, 24, 96 ó 384 pocillos que tienen el tamaño de cada pocillo de un diámetro de 12,3 cm x 8,1 cm, y la muestra de ADN o sangre se gotea y almacena en cada pocillo.

10. La tarjeta de ADN de tipo papel según la reivindicación 6, en la que la composición se prepara mezclando 0,1% a 1% (p/v) de quitosano hidrosoluble con 0,5 mM a 20 mM de ácido úrico en la relación de volúmenes 1:1.

11. La tarjeta de ADN de tipo papel según la reivindicación 7, en la que el tampón de lisis celular comprende Tris (8 mM), EDTA (0,5 mM), SDS (al 0,1% p/v) y ácido úrico (2 mM).

12. Un procedimiento para el ensayo de PCR sobre la tarjeta de ADN que comprende las etapas de: