PROCEDIMIENTO, CHIP, DISPOSITIVO Y SISTEMA DE EXTRACCION DE MATERIALES BIOLOGICOS.

Procedimiento para la extracción de material biológico de una espora bacteriana,

comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) proporcionar una cámara de muestra y un primer y un segundo electrodo, estando el primer y el segundo electrodo y la cámara de muestra situados de tal modo que al menos una parte de la cámara de muestra está entre el primer y el segundo electrodo, b) proporcionar una muestra líquida en la cámara de muestra, comprendiendo dicha muestra líquida una espora bacteriana, c) exponer dicha muestra líquida a un campo eléctrico alterno en dicha cámara de muestra, siendo proporcionado dicho campo eléctrico alterno por el primer y segundo electrodo y teniendo una amplitud suficiente como para extraer material biológico de la espora bacteriana, y d) realizar un análisis en una parte de la muestra líquida expuesta, dicha parte comprendiendo material biológico extraído de la espora bacteriana

CAMPO DE LA INVENCIÓN [0001]La presente invención está relacionada con un método para la extracción de material biológico de células biológicas. La invención implica la exposición de las partículas biológicas a un campo eléctrico alterno en una cámara de muestra y puede implicar también análisis posteriores del material biológico después de la extracción.

ANTECEDENTES [0002]En respuesta a las amenazas de bioterrorismo se ha hecho cada vez más importante realizar una detección rápida y precisa de agentes de guerra biológica. La bacteria Bacillus anthracis es un miembro del grupo formador de endosporas de Bacillus cereus. Bacillus anthracis es un agente de guerra biológica altamente letal que es fácil de obtener, almacenar y aplicar como un arma biológica. Para realizar una detección fiable de Bacillus anthracis debe analizarse el ADN, puesto que las diferencias fenotípicas entre los miembros del grupo de Bacillus cereus en algunas ocasiones son menores del 1%. [0003]Por ejemplo, Bacillus cereus difiere sólo de Bacillus anthracis en que el segundo contiene dos plásmidos adicionales llamados pXO1 y pOX2. Las cepas no virulentas de Bacillus anthracis que carecen de pXO1 y pXO2 son virtualmente indistinguibles de Bacillus cereus. En teoría, la transferencia de los plásmidos pXO1 y pXO2 a miembros del grupo de Bacillus cereus transformará estas bacterias en Bacillus anthracis funcionales. Por esta razón, el análisis de ADN y la discriminación de los plásmidos pXO1 y pXO2 por medio de hibridación de ADN, secuenciación o PCR es el único método válido para determinar si el organismo detectado es Bacillus anthracis. [0004]Debido a su capacidad para resistir en ambientes adversos, la liberación y extracción de ADN de una endospora es una tarea difícil. El procedimiento normal usado en la detección de Bacillus anthracis es germinar las esporas en un sustrato de cultivo, recoger las bacterias y posteriormente extraer el ADN de las bacterias vegetativas, un procedimiento que puede llevar desde muchas horas a un día (Levi et al 2003). Otros métodos incluyen técnicas elaboradas como ruptura mecánica, ciclos de congelación/descongelación o tratamiento químico (Johns et al 1994). Sin embargo, la cubierta y la corteza de la espora son estructuras bioquímicas desarrolladas para una hibernación prolongada que puede durar miles de años. Un ejemplo famoso es una bacteria revivida a partir de una endospora que se encontró en el intestino de una abeja embebida en ámbar (Cano & Borucki 1995). Además, la ruptura mecánica (golpeo con perlas) da como resultado una mala calidad del ADN liberado (Levi et al 2003). Usando la tecnología actual, es posible liberar el ADN en un periodo de 5-10 minutos a partir de las endosporas mediante la combinación de tratamientos físicos, mecánicos y químicos, pero incluso cinco minutos para la extracción de ADN se considera un tiempo largo cuando la aplicación es un control de ataques de bioterrorismo llevados a cabo mediante aerosoles. El uso de procedimientos multietapa elaborados no es óptimo en la situación de tensión que es un posible ataque con ántrax. Por esta razón existe la necesidad de una tecnología que permita una extracción rápida (en segundos) del ADN en un solo paso sin intervención directa, a partir de endosporas de bacterias Gram positivas. [0005]Las bacterias Gram positivas del género Bacillus y Clostridia son capaces de experimentar un proceso al final de la fase de crecimiento exponencial llamado esporulación. Durante la esporulación, las bacterias forman una espora resistente capaz de persistir en ambientes adversos. La espora es una estructura latente con sólo unas pocas enzimas metabólicas activas que inducen la germinación cuando la espora se expone a nutrientes. La espora es muy diferente en su composición bioquímica como se representa en la Tabla 1.

25 Tabla 1. Diferencias en la composición bioquímica existente entre las esporas y las células vegetativas de especies de Bacillus.

[0006]Las estructuras bioquímicas y el estado fisiológico latente hace a la endospora una entidad extremadamente resistente al calor, estrés mecánico y estrés químico, lo cual plantea un problema particular en términos de la rapidez en la preparación de la muestra y en la extracción de ADN de agentes de guerra biológica para conseguir una rápida identificación. Las esporas pueden resistir, por ejemplo, un hervido prolongado sin romperse. El destino final medioambiental de la espora no se conoce en detalle. Las esporas pueden sobrevivir “indefinidamente” en ambientes secos y protegidos. Excavaciones en el Parque Nacional Kruger en Sudáfrica revelaron esporas de B. anthracis de más de 200 años de edad (como se dató mediante el método de carbono 14) que aún eran capaces de germinar en el laboratorio. [0007]Los métodos más sensibles de detección de bacterias y virus se basan en conseguir acceso a los componentes intracelulares de los organismos, tales como su material genético. [0008]El documento US 2003/0.146.100 describe la separación dielectroforética de células de la sangre seguida de lisis electrónica en células aisladas y digestión, realizada en una microplaca con un conjunto de electrodos es una cámara de flujo. La electroforesis se realizó con un campo sinusoidal de 10 kHz y la lisis se realizó con una serie de 400 pulsos de 500 V y 50 s de duración o 40 pulsos de 200 V y 10 s de duración (onda cuadrada). [0009]El documento US 2002/0115201 describe lisis celular usando microondas en el intervalo de 2,45-310 GHz, liberando de este modo ADN de células en suspensión líquida. Se describe adicionalmente una cámara con electrodos externos planos paralelos para la aplicación de microondas, teniendo la cámara canales de flujo para proporcionar la muestra a la cámara. [0010]El documento US 4.970.154 describe un método para insertar genes ajenos en células usando radiofrecuencia de pulsos. Describe adicionalmente la electroporación y fusión de células suspendidas en una solución en una cámara usando campos eléctricos oscilantes de radiofrecuencia de pulsos entre electrodos en la cámara. La frecuencia varía desde 60 Hz a 10 MHz, con intensidades de campo de 100-400 V/cm. [0011]El documento WO99/57314A describe el aislamiento de ácido nucleico mediante el uso de campos eléctricos por medio de un portador de muestras en forma de microplaca (ejemplo 5). [0012]El documento WO2004/013329 describe un método de extracción de ADN para extraer ADN a partir de una muestra que incluye un material que contiene ADN (típicamente células bacterianas), comprendiendo el método las etapas de proporcionar una microplaca de extracción de ADN que incluye un canal principal; suministrar flujos paralelos primero y segundo a través del canal principal, siendo el primer flujo de una muestra que incluye material que contiene ADN y el segundo flujo de un medio de separación; aplicar un campo de electroporación al primer flujo de muestra que incluye un material que contiene ADN de modo que se efectúe la electroporación del material que contiene ADN; y aplicar un campo de electroseparación a lo largo del canal principal de modo que se efectúe electroseparación de ADN del material que contiene ADN sometido a electroporación en el primer flujo hacia el segundo flujo paralelo. [0013]El documento WO97/08293A describe un método para la liberación de material intracelular desde células, que comprende: la aplicación de cómo máximo 50 V a una suspensión que contiene las células. También se reivindica un método para producir ácido nucleico monocatenario que comprende la liberación de ácido nucleico bicatenario a partir de células como se ha descrito anteriormente usando un electrodo y la desnaturalización del ácido nucleico mediante la aplicación de un voltaje a la suspensión con el electrodo para convertir el ácido nucleico bicatenario en ácido nucleico monocatenario. [0014]El documento WO99/28742A describe un método en el que se rompen células biológicas para extraer los contenidos celulares para su análisis mediante su sometimiento a un campo eléctrico. Las células se ponen en contacto con una sustancia para estimular la ruptura celular, antes de o mientras el campo eléctrico afecta a las células. [0015]El documento US5891694 describe un método para la recuperación de ácido nucleico que comprende: la aplicación de una corriente eléctrica a una solución...

1. Procedimiento para la extracción de material biológico de una espora bacteriana, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) proporcionar una cámara de muestra y un primer y un segundo electrodo, estando el primer y el segundo electrodo y la cámara de muestra situados de tal modo que al menos una parte de la cámara de muestra está entre el primer y el segundo electrodo, b) proporcionar una muestra líquida en la cámara de muestra, comprendiendo dicha muestra líquida una espora bacteriana, c) exponer dicha muestra líquida a un campo eléctrico alterno en dicha cámara de muestra, siendo proporcionado dicho campo eléctrico alterno por el primer y segundo electrodo y teniendo una amplitud suficiente como para extraer material biológico de la espora bacteriana, y d) realizar un análisis en una parte de la muestra líquida expuesta, dicha parte comprendiendo material biológico extraído de la espora bacteriana.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la espora bacteriana se selecciona del género Bacillus y/o del género Clostridium.

3. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la espora bacteriana es del grupo Bacillus.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la espora bacteriana es Bacillus anthracis.

5. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el primero y segundo electrodos están separados por una distancia que es como máximo de 20 mm.

6. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la espora bacteriana está unida a y/o localizada entre el primer y el segundo electrodo.

7. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la frecuencia del campo eléctrico alterno es de al

menos 5 kHz.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la frecuencia del campo eléctrico alterno es de al menos 100 kHz.

9. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el campo eléctrico alterno se crea mediante la modulación de la polaridad del primer y del segundo electrodo.

10. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el campo eléctrico alterno tiene una forma seleccionada del grupo que consiste en: rectangular, sinusoide, diente de sierra, triangular asimétrica, triangular simétrica; o cualquier combinación de las mismas.

11. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el campo eléctrico alterno, en el dominio de frecuencia, comprende al menos un primer y un segundo componente de frecuencia.

12. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el material biológico comprende un componente seleccionado del grupo que consiste en un orgánulo celular, un material genético y una proteína.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el material genético comprende ADN cromosómico y/o ADN plasmídico y/o cualquier tipo de ARN.

14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la proteína se selecciona del grupo que consiste en enzimas, proteínas estructurales, proteínas de transporte, canales iónicos, toxinas, hormonas y receptores.