VARIANTES DE PROCESAMIENTO DE CD38 Y USOS DE LAS MISMAS.

Variante de procesamiento de CD38 purificada que comprende el polipéptido de secuencia SEC ID nº 1

Variantes de procesamiento de CD38 y usos de las mismas.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere de manera general a los campos de la biología molecular y de la inflamación. Más específicamente, la presente invención se refiere a la identificación de nuevas variantes de CD38 y a usos de las mismas.

Los linfocitos T que portan el receptor CD4 (CD4⁺), denominados células T CD4⁺, incrementan la respuesta inmunológica mediante la secreción de citoquinas que estimulan una respuesta de células T citotóxicas (células T ayudantes 1) o una respuesta de anticuerpos (células T ayudantes 2). Las células T CD4⁺ no expuestas pueden diferenciarse para formar células Th1 o Th2 tras la formación del complejo péptido TCR-MHC de clase II, dependiendo de las citoquinas existentes en el ambiente. De esta manera, las células T CD4⁺ desempeñan un papel crítico en las respuestas inmunológicas mediadas por las células T. Los nuevos genes que funcionan en la activación de las células T podrían proporcionar nuevas dianas farmacológicas para las enfermedades autoinmunológicas e inflamatorias. Por consiguiente, se considera importante la identificación y caracterización de nuevos genes implicados en la activación de las células T CD4⁺.

CD38 es un antígeno de superficie celular multifuncional con actividad en la adhesión celular, la transducción de señales y la señalización del calcio. CD38 cataliza la producción de ADP ribosa cíclica (ADPRc) a partir de su sustrato, NAD⁺ (Takasawa, S. et al., J. Biol. Chem. 268:26052-26054, 1993). La ADPRc actúa como segundo mensajero que regula la liberación del calcio intracelular. CD38 se expresa en células hematopoyéticas, incluyendo linfocitos T, linfocitos B y neutrófilos. Los ratones CD38 -/- muestran una pérdida completa de actividad de NAD+ glicohidrolasa asociada a tejidos y muestran deficiencias marcadas en las respuestas de anticuerpos frente a proteínas antígenos dependientes de células T (Cockayne et al., Blood 92:1324-1333, 1998). CD38 controla la quimiotaxis de neutrófilos a quimioatrayentes bacterianos mediante la producción por parte de las mismas de ADP-ribosa cíclica, y actúa como un regulador crítico de la inflamación y de las respuestas inmunológicas innatas (Partida-Sánchez S. et al., Nat. Med. 7:1209-16, 2002). El ADNc humano de CD38 se clonó por primera vez en 1990, y codifica 300 aminoácidos (Jackson, D.G., Bell, J.I., J. Immun. 144:2811-2815, 1990). Se ha informado de que el gen CD38 se encuentra presente en una única copia y que se extiende a lo largo de más de 62 kb. Consiste de 8 exones y 7 intrones, incluyendo un intrón largo que interrumpe la región codificante 5' (Ferrero, E.; Malavasi, F., J. Immun. 159:3858-3865, 1997). La estructura de la proteína CD38 no se conoce.

Es conocido que los antígenos de superficie celular, tales como CD38, presentan diferentes isoformas que son estructural y funcionalmente diferentes entre sí. Por ejemplo, CXCR-3 presenta dos isoformas, CXCR3A y CXCR3-B, que se ha encontrado que presentan diferentes actividades biológicas y que desencadenan diferentes rutas de transducción de señales. CXCR3-B muestra afinidad elevada únicamente para CXCL4, mientras que CXR3-A, no (Lasagni, L. et al., J. Exp. Med. 197:1537-49, 2003).

La patente US nº 6.607.879 B1 da a conocer un sistema basado en micromatrices que comprende una "pluralidad" de sondas de ADNc, sondas que se utilizan como elementos hibridables para la detección de alteraciones de la expresión de los genes en muestras biológicas. Se da a conocer que CD38 es un gen de entre 1.507 otros genes, el nivel de expresión de los cuales se cree que resulta afectado por determinadas enfermedades, incluyendo inmunopatologías, enfermedad de Crohn, asma, colitis ulcerosa, síndrome del intestino irritable y artritis reumatoide.

Una isoforma de procesamiento del ADNc de CD38 que únicamente codifica 122 residuos aminoácidos se ha aislado a partir de una biblioteca de testículo humano (Nata, K. et al., Gene 186:285-292, 1997).

Lund et al., Immun. Rev. 161:79-93, 1998, describen CD38 como una glucoproteína transmembranal de tipo II que se expresa extensivamente sobre células de linaje hematopoyético y no hematopoyético. También dan a conocer mutantes de CD38 para análisis funcionales de este receptor. Los autores sugieren que la señalización a través de CD38 representa un paradigma en la transducción de señales linfocitarias y se refiere a la comunicación extracelular y no intracelular.

Los anticuerpos, especialmente los anticuerpos monoclonales contra CD38 humanizados, se dan a conocer en el documento US nº 2002/0164788 A1. Dichos anticuerpos se comentan para el tratamiento del cáncer, por ejemplo del mieloma múltiple y del linfoma, y de enfermedades autoinmunológicas, por ejemplo la artritis reumatoide.

El documento WO nº 94117184 A1 da a conocer anticuerpos contra CD38 y propone que las respuestas fisiológicas de los linfocitos pueden estar moduladas por dichos anticuerpos que actúan contra CD38 y por un dominio extracelular soluble de CD38 con una longitud de 259 aminoácidos. También se comenta que podría utilizarse una fusión de un dominio extracelular soluble de CD38 con, por ejemplo, una proteína "señalizadora", para el cribado de moduladores farmacológicos de la actividad de CD38. Sin embargo, este dominio extracelular de CD38 no es idéntico a la variante de procesamiento relevante para la invención que se comenta en la presente memoria.

El documento WO nº 00/14116 A1 da a conocer la idea de que una combinación de los denominados péptidos receptores de células T y los denominados péptidos marcadores de activación de las células T puede utilizarse para el tratamiento de enfermedades autoinmunológicas mediadas por células T, por ejemplo la artritis reumatoide o la esclerosis múltiple. Dichos péptidos marcadores de activación de las células T, de longitud comprendida entre 15 y 30 aminoácidos, podrían derivarse a partir de dominios extracelulares de diferentes receptores, entre ellos CD38. Sin embargo, no existe ninguna divulgación específica de regiones determinadas de CD38 que puedan aplicarse eficazmente a dicho fin determinado.

El descubrimiento de una nueva isoforma de CD38 y de polinucleótidos codificantes de la misma satisface una necesidad de la técnica mediante la provisión de nuevas composiciones que pueden utilizarse en el tratamiento, prevención y diagnóstico de enfermedades autoinmunológicas e inmunológicas.

Breve sumario de la invención

La invención proporciona un polipéptido purificado denominado en la presente invención CD38JL que es una variante de procesamiento de CD38 que comprende el polipéptido de 81 aminoácidos de secuencia SEC ID nº 1. Los residuos aminoácidos 1 a 57 de la secuencia SEC ID nº 1 corresponden a residuos aminoácidos que se encuentran en la secuencia de CD38 y a los que se asocia la actividad de la ADP-ribosilciclasa.

Asimismo, la invención proporciona un fragmento de polipéptido purificado de CD38JL que comprende los residuos 58 a 81 de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 1.

Además, la invención proporciona un polinucleótido aislado y purificado codificante de la variante de procesamiento CD38 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1 o un fragmento de la secuencia SEC ID nº 1 que comprende los residuos aminoácidos 58 a 81 de la secuencia SEC ID nº 1.

La invención también proporciona un vector de expresión que contiene por lo menos un polinucleótido codificante de la variante de procesamiento de CD38 que consiste de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1 o de los residuos aminoácidos 58 a 81 de la secuencia SEC ID nº 1. En otra realización, el vector de expresión se encuentra contenido en una célula huésped.

Un objetivo de la invención es un método para tratar la IBD (enfermedad intestinal inflamatoria), que comprende la etapa de administrar en un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de polipéptido inhibidor o de antagonista de la variante de procesamiento CD38JL.

Un objetivo adicional de la invención es un método para tratar la IBD (enfermedad intestinal inflamatoria) que comprende la etapa de administrar en un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista de la variante de procesamiento CD38JL.

La...

1. Variante de procesamiento de CD38 purificada que comprende el polipéptido de secuencia SEC ID nº 1.

2. Variante de procesamiento de CD38 purificada que comprende los residuos aminoácidos 58 a 81 de la secuencia SEC ID nº 1.

3. Polinucleótido aislado y purificado codificante de la variante de procesamiento de CD38 que comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEC ID nº 1 o un fragmento de la secuencia SEC ID nº 1 que comprende los aminoácidos 58 a 81.

4. Polinucleótido aislado y purificado según la reivindicación 3 que comprende las bases 603 a 845 de la secuencia SEC ID nº 2 o las bases 774 a 845 de la secuencia SEC ID nº 2.

5. Polinucleótido aislado y purificado que es complementario al polinucleótido codificante de la variante de procesamiento de CD38 que consiste de la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEC ID nº 1 o de un fragmento de la secuencia SEC ID nº 1 que comprende los residuos aminoácidos 58 a 81 de la secuencia SEC ID nº 1.

6. Vector de expresión que contiene por lo menos un polinucleótido codificante de la variante de procesamiento de CD389 que consiste de la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEC ID nº 1 o de los residuos aminoácidos 58 a 81 de la secuencia SEC ID nº 1.

7. Vector de expresión según la reivindicación 6 contenido en una célula huésped.

8. Composición farmacéutica que comprende una variante de procesamiento de CD38 purificada que presenta la secuencia SEC ID nº 1 según la reivindicación 1, conjuntamente con un portador farmacéutico aceptable.

9. Método para detectar una secuencia polinucleótido codificante de una variante de procesamiento de CD38 tal como se define en la secuencia SEC ID nº 1 en una muestra biológica que contiene ácidos nucleicos, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

(a) hibridar el complemento del polinucleótido codificante del polipéptido que comprende la secuencia SEC ID nº 1 o un fragmento de la misma con por lo menos uno de los ácidos nucleicos de la muestra biológica, formando de esta manera un complejo de hibridación, y

(b) detectar el complejo de hibridación, en el que la presencia del complejo de hibridación se correlaciona con la presencia de un polinucleótido codificante de la variante de procesamiento de CD38 en la muestra biológica.

10. Anticuerpo purificado que se une específicamente a las posiciones 58 a 81 de una variante de procesamiento de CD38 que presenta la secuencia SEC ID nº 1.

11. Utilización de la variante de procesamiento de CD38 que presenta la secuencia SEC ID nº 1 en un ensayo de cribado y/o en un ensayo de rendimiento ultraelevado para identificar inhibidores de molécula pequeña de dicho polipéptido.

12. Utilización de la variante de procesamiento de CD38 que presenta la secuencia SEC ID nº 1 para cribar bibliotecas de agentes farmacéuticos con el fin de identificar aquellos que se unen específicamente a dicho polipéptido.

13. Utilización de la variante de procesamiento de CD38 que presenta la secuencia SEC ID nº 1 para producir anticuerpos que se unen específicamente a dicho polipéptido.