Un kit de inmunoanálisis sándwich que detecta CD14 humana bajo peso molecular,

sin detectar CD14 humana de elevado peso molecular, que comprende:

(a) un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2; y

(b) un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la posición de 17a a la posición de 26a del SEQ ID NO: 5;

donde dicha CD14 humana bajo peso molecular tiene rasgos característicos siguientes;

(1) no se une al anticuerpo F1025-3-1 (Núm. Acceso FERM BP-7296),

(2) muestra un pico en un intervalo de peso molecular de 25 a 45 kDa en una cromatografía de filtración en gel, y

(3) se puede obtener de sangre humana

Kit de análisis para CD14 humana de bajo peso molecular y anticuerpo.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un anticuerpo que se une a un péptido que tiene una secuencia especifica de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos para CD14 humana de elevado peso molecular.

Además, la presente invención se refiere a un kit de análisis para CD14 humana de bajo peso molecular y un método de medición de la misma. Por otra parte, la presente invención se refiere a un método de diagnóstico novedoso de la sepsis en el que se determina directamente CD14 humana bajo peso molecular.

Técnica anterior

Una molécula CD14 fue nombrada como una proteína identificada por una familia de anticuerpos que reconocen las glicoproteínas expresadas en la superficie de la membrana de los monocitos en la Tercera Conferencia de Tipificación de Leucocitos, 1986. En 1990, Wright et al. dilucidaron que la molécula de CD14 es un receptor de LPS, endotoxina ("Science", vol. 249, págs. 1431-1433, 1990). La molécula de CD14 es una glucoproteína que tiene un peso molecular de 53-55 kDa, y los análisis de ADNc revelaron que el ARNm de 1,4 KB tiene una secuencia codificante de 356 aminoácidos ("Nucleic Acids Research" (U.K.), vol. 16, págs. 4173, 1988).

Se informó de que las moléculas de CD14 humanas incluyen moléculas de CD14 soluble además de moléculas de CD14 unidas a membrana y la sangre contiene moléculas de CD14 soluble que tienen diferentes pesos moleculares ("European Journal of Immunology" (Alemania), vol. 23, págs. 2144-2151, 1993). Además, Landmann, et al. realizaron análisis de transferencia Western de CD14 soluble en el suero de pacientes que sufrían sepsis e informaron de que CD14 soluble de aproximadamente 55 kDa se encontraba a altos niveles en pacientes no supervivientes a la sepsis y en pacientes con hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN), y que en sueros normales, no se detectó esta molécula, pero se detectó CD14 soluble de 49 kDa, un peso molecular ligeramente menor que el anterior ("The Journal of Infectious Disease", vol. 171, págs. 639-644, 1995).

Stelter informó de que la diferencia en las cadenas de azúcar que participan en los subtipos que tienen diferentes pesos moleculares y dos subtipos de CD14 soluble que tienen diferentes pesos moleculares se encuentran en la sangre, incluso después de la eliminación de las cadenas de azúcar unidas a N y a O ("European Journal of Biochemistry" (Alemania), vol. 236, págs. 457-464, 1996). Además, Bufler et al. llevaron a cabo el análisis C-terminal de CD14 soluble e informaron de que un grupo GPI se une a un residuo serina en la posición 327 de CD14 soluble y que una molécula de CD14 soluble que tiene un peso molecular de aproximadamente 56 kDa es una de las especies moleculares a las que no está anclada GPI ("European Journal of Immunology" (Alemania), vol. 25, págs. 604-610, 1995).

Los anticuerpos contra las moléculas de CD14 incluyen muchos anticuerpos anti-CD14, que se han elaborado y utilizado en la identificación de proteínas CD14, tales como MEM-18 preparado por Bazil et al. ("European Journal of Immunology" (Alemania), vol. 16, págs. 1583-1589, 1986), RoMo-1 preparado por Shutt et al. ("Allergie und Immunologie" (Alemania), vol. 34, págs. 17-26, 1988), y 3C10 preparado por Steinman et al. ("Journal of Experimental Medicine" (EE.UU.), vol. 158, págs. 126-145, 1983).

Además, los sistemas de análisis para CD14 solubles que utilizan los anticuerpos han sido referidos por Shutt et al. (DE-286876-A), Bazil et al. ("Molecular Immunology" (Reino Unido), vol. 26, págs. 657-662, 1989), y Grünwald et al. ("Journal of Immunological Methods" (Holanda), vol. 155, págs. 225-232, 1992), permiten el análisis de la CD14 soluble en fluidos corporales humanos.

Además, se han comercializado kits de ELISA para CD14 soluble de IBL-Hanburg, Medgenix, y R & D Systems, y se ha realizado el análisis de CD14 soluble de muchas enfermedades tales como la sepsis ("Clinical Immunology and Immunopathology" (EE.UU.), vol. 80, págs. 307-310, 1996, Y "Rinshokensa", vol. 38, págs. 341-344, 1994).

Sin embargo, se constató que CD14 soluble no es un marcador especifico de la sepsis debido a los incrementos en los niveles de las moléculas de CD14 soluble de aproximadamente 55 kDa y 49 kDa (de informe a informe, los pesos moleculares son diferentes y no se limitan a alrededor de 55 kDa y 49 kDa, y lo mismo se aplicará en la siguiente descripción) en función del grado en el que transcurren las enfermedades, incluso en enfermedades salvo la sepsis ("Infection and Immunity" (EE.UU.), vol. 67, págs. 417-420, 1999; "Clinical and Experimental Immunology" (U.K.), vol. 120, págs. 483-487, 2000; "Clinical Experimental Immunology" (U.K.), vol. 96, págs. 15-19, 1994). Además, se espera que la CD14 soluble sea un indicador de la gravedad de la sepsis. Sin embargo, la CD14 soluble no se ha proporcionado como un producto para el diagnóstico de la sepsis, debido a la no correlación con el choque séptico ("Pediatric allergy and inmunology") (Dinamarca), vol. 8, págs. 194-199, 1997) y también la no correlación con el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) ("European Journal of Clinical Investigation" (U.K.), vol. 28, págs. 672-678, 1998).

Los autores de la presente invención han descubierto la presencia de una molécula de CD14 soluble con un bajo peso molecular de aproximadamente 36 kDa en la sangre, además de otras como los dos tipos de moléculas de CD14 soluble descritas anteriormente de alrededor de 55 kDa y 49 kDa referidas por Landmann et al. (CD14 elevado peso molecular (de informe a informe, los pesos moleculares son diferentes y no se limitan a alrededor de 55 kDa y 49 kDa, y lo mismo se aplicará en la siguiente descripción). Los autores de la presente invención han encontrado también la presencia de una pequeña cantidad de CD14 de bajo peso molecular en los individuos normales y de una mayor cantidad de CD14 de bajo peso molecular en pacientes que sufren sepsis. En consecuencia, los autores de la presente invención han validado la eficacia clínica del análisis en una CD14 soluble de bajo peso molecular. Sin embargo, los anticuerpos anti-CD14 conocidos en la técnica son los que reconocen una proteína CD14 soluble de elevado peso molecular o los que reconocen las proteínas CD14 solubles tanto de alto como de bajo peso molecular. Así pues, no se ha conocido en la técnica un anticuerpo que reconozca sólo una CD14 de bajo peso molecular. Además, se ha considerado que la secuencia de aminoácidos de la proteína CD14 de bajo de peso molecular es idéntica a una parte de la secuencia de aminoácidos de la proteína CD14 soluble de elevado peso molecular, de manera que se considera que es difícil la preparación de un anticuerpo como se ha descrito antes y un análisis inmunológico directo de CD14 de bajo peso molecular, utilizando el anticuerpo. Por lo tanto, como análisis para CD14 soluble de bajo peso molecular, existe una propuesta en la que el nivel de CD14 de bajo peso molecular en sangre se obtiene de forma indirecta, restando el nivel de CD14 de elevado peso molecular en sangre del nivel total de la CD14 soluble en sangre (Publicación Internacional WO 01/22085).

Descripción de la invención

En tales circunstancias, se ha deseado un análisis para determinar cualitativamente o cuantitativamente CD14 humana de bajo peso molecular con alta sensibilidad y especificidad de una manera conveniente, permitiendo el ensayo la determinación directa de la CD14 humana de bajo peso molecular y siendo útil para el diagnóstico de un paciente que sufre sepsis, y un kit de análisis para su análisis. Además, se ha deseado un anticuerpo contra la CD14 humana de bajo peso molecular útil para el análisis.

Los autores de la presente invención han inventado, como resultado de un estudio extenso, un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, preparado utilizando un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2. Además, los autores de la presente invención han inventado un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4 que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la posición 17^a a la posición 26^a del SEQ ID NO: 5, así como un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5, que compite con el mismo.

Además, los autores de la presente invención han inventado una prueba para determinar específicamente CD14 humana de bajo peso molecular de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 6 y un kit de análisis...

1. Un kit de inmunoanálisis sándwich que detecta CD14 humana bajo peso molecular, sin detectar CD14 humana de elevado peso molecular, que comprende:

2. Un kit de inmunoanálisis sándwich que detecta CD14 humana bajo peso molecular sin detectar CD14 humana de elevado peso molecular, que comprende:

3. Un anticuerpo que se une a CD14 humana bajo peso molecular, pero no a CD14 de elevado peso molecular donde el anticuerpo se prepara mediante el uso de un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 como antígeno, donde dicha CD14 humana de bajo peso molecular tiene los rasgos característicos siguientes;

4. Un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la posición 17^a a la posición de 26^a del SEQ ID NO: 5.

5. Un anticuerpo que compite con un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la posición de 17^a a la posición 26^a del SEQ ID NO: 5.

6. Un método in vitro para detectar CD14 humana de bajo peso molecular sin detectar CD14 humana de elevado peso molecular mediante un kit de inmunoanálisis sándwich que comprende:

7. Un método in vitro para detectar CD14 humana de bajo peso molecular sin detectar CD14 humana de elevado peso molecular mediante un kit de análisis sándwich que comprende:

8. Un método in vitro para la detección de la sepsis en la sangre de un paciente que comprende las etapas de: medir la cantidad de una CD14 humana de bajo peso molecular en la sangre del paciente mediante un equipo de inmunoanálisis sándwich que comprende:

comparando la cantidad medida con una cantidad patrón de un individuo normal, y evaluando si la cantidad medida es superior a la cantidad patrón de un individuo normal.

9. Un método in vitro para la detección de la sepsis en la sangre de un paciente que comprende las etapas de: la medición de una cantidad de una CD14 humana de bajo peso molecular en la sangre de un paciente mediante un equipo de inmunoanálisis sándwich que comprende:

comparando la cantidad medida con una cantidad patrón de un individuo normal, y evaluando si la cantidad medida es superior a la cantidad patrón de un individuo normal.