PROCEDIMIENTOS PARA PURIFICAR PROTEINAS ALTAMENTE ANIONICAS.
Procedimiento para purificar una proteína diana altamente aniónica en una muestra a partir de una serie de complejos ADN/histona,
que comprende las etapas de:
(a) purificar la proteína diana mediante cromatografía de intercambio de iones;
(b) cargar la muestra que contiene la proteína purificada mediante cromatografía de intercambio de iones en una columna de cromatografía de quelato metálico, donde la proteína es capturada en la columna; y
(c) lavar la columna,
donde el paso de carga (b) utiliza una solución que comprende NaCl 2M para retirar el ADN de la muestra
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E06006740.
Solicitante: GENETICS INSTITITE, LLC.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 87 CAMBRIDGE PARK DRIVE,CAMBRIDGE, MA 02140.
Inventor/es: COFFMAN, JONATHAN, L., FOSTER, WILLIAM, BARRY, GERMAIN, BONNIE, J., SUN, SHUJUN, ROBINSON, JEFFREY, J.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 27 de Marzo de 2001.
Fecha Concesión Europea: 11 de Noviembre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K1/18 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 1/00 Procedimientos generales de preparación de péptidos. › Cromatografía de intercambio iónico.
- C07K1/20 C07K 1/00 […] › Cromatografía de partición, fase inversa o hidrófoba.
- C07K1/36 C07K 1/00 […] › por una combinación de varios procesos de diferentes tipos.
- C07K14/705Z
Clasificación PCT:
- C07K1/20 C07K 1/00 […] › Cromatografía de partición, fase inversa o hidrófoba.
- C07K14/705 C07K […] › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Receptores; Antígenos celulares de superficie; Determinantes celulares de superficie.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.
Fragmento de la descripción:
Procedimientos para purificar proteínas altamente aniónicas.
Antecedentes de la invención
La purificación de proteínas se ve a menudo obstaculizada por una escasa retirada del ADN debido a las interacciones entre las proteínas y el ADN. Las interacciones entre las proteínas y el ADN son más problemáticas en la purificación de proteínas diana altamente aniónicas, por ejemplo proteínas sulfatadas.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona procedimientos para aislar y purificar proteínas diana altamente aniónicas y proteínas diana que comprenden campos de inmunoglobulinas, por ejemplo, proteínas sulfatadas. Las proteínas aniónicas son proteínas que tienen una carga negativa. Las proteínas sulfatadas son proteínas en las cuales la carga negativa neta se debe a al menos cerca de un (1) residuo sulfatado. La sulfatación de una proteína sulfatada se refiere a la sustitución de al menos un grupo de hidroxilo (-OH) con -SO4H en o entre el aminoácido o aminoácidos contenidos dentro de la proteína diana. En una realización preferida, la proteína sulfatada tiene al menos cerca de un (1) grupo sulfato. Los procedimientos de esta invención abarcan igualmente las proteínas sulfatadas que contienen al menos cerca de dos (2), tres (3), cuatro (4), cinco (5), seis (6) o más grupos sulfato, por ejemplo, seis grupos sulfato en las tirosinas de N-terminales tal como se indica en PSGL-1 (Ligando-1 de las Glucoproteínas de la Selectina-P).
En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para purificar proteínas diana altamente aniónicas que comprende los pasos de la cromatografía de intercambio de iones en condiciones apropiadas para la purificación de proteínas diana. Por ejemplo, este procedimiento permite (1) poner en contacto la muestra con un substrato que pueda fijar reversiblemente moléculas cargadas, con lo que las proteínas diana se fijan al substrato, (2) lavar el substrato con una primera solución de lavado en condiciones apropiadas, con lo que una serie de impurezas proteínicas y no proteínicas en la muestra bien no se fijan o bien se lavan del substrato mientras las proteínas diana altamente aniónicas continúan fijadas, (3) eluir la muestra con una primera solución de elución donde la primera solución de elución comprende una solución salina a una concentración altamente molar, y (4) recoger la muestra eluída que contiene proteínas diana aniónicas purificadas.
En una realización, el pH de la primera solución de lavado es aproximadamente 4,0 a 6,0. En otra realización, el pH de la primera solución de lavado es aproximadamente 6,5.
En una realización preferida, la proteína diana altamente aniónica es una proteína sulfatada y las impurezas incluyen una forma sulfatada de la proteína diana.
En otro aspecto, se purifica adicionalmente la muestra eluída, procedente de la purificación mediante cromatografía de intercambio de iones, que contiene las proteínas diana purificadas. Esta purificación adicional comprende el paso de la cromatografía de quelato metálico en condiciones apropiadas para la purificación de proteínas diana altamente aniónicas. Dicha purificación adicional permite los pasos de (1) pasar la muestra eluída que contiene las proteínas diana a través de una columna de cromatografía de quelato metálico, con lo que la muestra eluída es capturada en la columna, (2) lavar la columna con una segunda solución de lavado bajo condiciones apropiadas, con lo que se disocian los complejos de ADN/histona contenidos en la muestra, (3) eluir la muestra con una segunda solución de elución, y (4) recoger la muestra eluída que contiene las proteínas diana purificadas altamente aniónicas.
En condiciones cromatográficas de quelación del hierro, por ejemplo, la segunda solución de lavado comprende una concentración de sal de aproximadamente 2M, y la segunda solución de elución comprende una concentración de sal de aproximadamente 200 mM a 1M. Como variante, en condiciones de cromatografía de quelato de hierro, la segunda solución de lavado comprende MES a aproximadamente 40 mM, NaCl a aproximadamente 2M, e imidazol a aproximadamente 5 mM, y la segunda solución de elución comprende una solución de MES de aproximadamente 40 mM, NaCl a aproximadamente 1M e imidazol a aproximadamente 35 mM.
En otro aspecto, las proteínas diana tienen al menos cerca de una (1) sulfatación o sulfataciones. La presente invención también abarca las proteínas diana aniónicas que tienen al menos cerca de dos (2), tres (3), cuatro (4), cinco (5), seis (6) o más sulfataciones, por ejemplo proteínas PSGL-1. Las proteínas aniónicas capaces de ser purificadas según la presente invención pueden ser proteínas naturales o bien recombinantes.
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la purificación de proteínas altamente aniónicas que comprenden un campo de immunoglobulinas (por ejemplo un campo de immunoglobulinas Fc), tal como una proteína de fusión PSGL-1. Este procedimiento comprende los pasos de (1) poner en contacto la muestra con un substrato que puede fijar la parte Fc de la proteína diana que comprende un campo de inmunoglobulinas, con lo que las moléculas diana se fijan al substrato, (2) lavar el substrato con una primera solución de lavado en condiciones apropiadas para lavar los contaminantes contenidos en la muestra, (3) eluir la muestra con una primera solución de elución, donde el pH de la primera solución de elución es bajo, por ejemplo cerca de 4,0, y (4) recoger la muestra eluída que contiene las proteínas diana purificadas altamente aniónicas.
En otra realización, se purifica adicionalmente la muestra eluída procedente del substrato de fijación del Fc, que contiene las proteínas diana purificadas altamente aniónicas que comprenden un campo de immunoglobulinas. Por ejemplo, la purificación adicional comprende los pasos de (1) poner en contacto la muestra eluída que contiene las proteínas diana aniónicas purificadas que comprenden un campo de immunoglobulinas con un substrato que puede fijar reversiblemente moléculas cargadas con lo que una serie de impurezas proteínicas y no proteínicas en la muestra o bien no se fijan o bien se lavan del substrato mientras que las proteínas diana continúan fijadas al substrato, (2) lavar el substrato con una segunda solución de lavado donde el pH de la segunda solución de lavado es bajo, por ejemplo de aproximadamente 4,0, (3) eluir la muestra con una segunda solución de elución, y (4) recoger la muestra eluída que contiene las proteínas diana purificadas aniónicas que comprenden un campo de immunoglobulinas.
En un aspecto, las proteínas diana que comprenden un campo de immunoglobulinas tienen al menos una (1) sulfatación o sulfataciones. La presente invención también abarca a las immunoglobulinas que comprenden proteínas con al menos dos (2), tres (3), cuatro (4), cinco (5), seis (6) o más sulfataciones, por ejemplo proteínas PSGL-Ig.
En una realización preferida, los procedimientos de purificación de la invención proporcionan proteínas diana purificadas altamente aniónicas y proteínas purificadas altamente aniónicas que comprenden un campo de immunoglobulinas (por ejemplo PSGL-Ig) con una pureza mínima del 99,9% aproximadamente de proteínas contaminadas.
En otra realización, los procedimientos de purificación de la invención retiran al menos un 95% o 2,5 log10 aproximadamente de valor de retirada (LRV) del ADN contaminante de las proteínas diana altamente aniónicas y de las proteínas altamente aniónicas que comprenden un campo de immunoglobulinas.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1-3 ilustran los procedimientos de purificación descritos en la presente, por ejemplo los procesos I-III, tal como se describen en los Ejemplos.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de nuevos procedimientos para purificar proteínas diana altamente aniónicas y proteínas altamente aniónicas que comprenden un campo de immunoglobulinas, por ejemplo, proteínas sulfatadas (tal como la PSGL-1). Las proteínas aniónicas son proteínas que tienen una carga negativa. Las proteínas sulfatadas son proteínas aniónicas en las que la carga negativa se debe a al menos una, o más preferentemente, cinco (5) o más sulfataciones, por ejemplo al menos aproximadamente seis (6) sulfataciones....
Reivindicaciones:
1. Procedimiento para purificar una proteína diana altamente aniónica en una muestra a partir de una serie de complejos ADN/histona, que comprende las etapas de:
donde el paso de carga (b) utiliza una solución que comprende NaCl 2M para retirar el ADN de la muestra.
2. Procedimiento para purificar una proteína diana altamente aniónica en una muestra a partir de una serie de complejos ADN/histona, que comprende las etapas de:
donde el paso de carga (c) utiliza una solución que comprende NaCl 2M para retirar el ADN de la muestra.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2 donde la proteína es hipersulfatada.
4. Procedimiento según la reivindicación 3 donde la proteína es PSGL-1.
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