PROTEINA RECEPTORA CD81 DE LA HEPATITIS C.

Un fragmento EC2 de la proteína CD81, que consta de los aminoácidos 113-201 de la secuencia de CD81 humano enumerado en la base de datos SWISSPROT (nº de registro P18582) o la base de datos EMBL/GENBANK (nº de registro M33680),

o que tiene, al menos, una homología del 80% con los aminoácidos 113-201 de la secuencia de CD81 humana, en la que la homología se define usando el paquete de software de análisis de secuencia Pileup (Wisconsin, 1996), para usar en el tratamiento o diagnóstico de la infección por VHC

Proteína receptora CD81 de la hepatitis C.

La presente invención se refiere al uso de un fragmento EC2 de la proteína CD81 y el ácido nucleico que codifica esta proteína en el tratamiento y diagnóstico de la hepatitis C y a composiciones farmacéuticas, modelos animales y kit diagnósticos para dichos usos.

El VHC (anteriormente conocido como hepatitis NoANoB, VNANB, es un virus de ARN de sentido positivo de aproximadamente 10.000 nucleótidos con un único marco de lectura abierto que codifica una poliproteína de aproximadamente 3.000 aminoácidos. Aunque la estructura del virus se ha aclarado mediante técnicas de ADN recombinante (solicitud de patente europea EP-A-0318216 y solicitud de patente europea EP-A-0388232), todavía no se ha aislado el propio virus y las funciones de las diversas proteínas víricas producidas por proteólisis de la poliproteína únicamente se han deducido mediante analogía con otros virus similares de organización genómica similar (Choo y col. PNAS USA (1991) 88 2451-2455).

Todas las proteínas víricas están disponibles en forma recombinante, expresadas en diversas células y tipos celulares, incluidos levaduras, bacterias, insectos, plantas y células de mamífero (Chien, D.Y. y col. PNAS USA (1992) 89 10011-10015 y Spaete, R.R. y col Virology (1992) 188 819-830).

Se ha sugerido que dos proteínas, denominadas E1 y E2 (correspondientes a los aminoácidos 192-383 y 384-750 de la poliproteína del VHC respectivamente) son proteínas externas de la cubierta vírica que son responsables de la unión del virus a las células diana.

La investigación sobre el VHC se ha retrasado muy considerablemente por el limitado abanico de huéspedes para los virus. El único modelo animal fiable para la infección por el VHC es el chimpancé y el VHC no se propaga con facilidad en los cultivos tisulares.

En nuestra solicitud de patente internacional pendiente de tramitación PCT/IB95/00692 (documento WO 96/ 05513), los inventores describen un procedimiento que emplea citometría de flujo para identificar células portadoras del receptor del VHC. Los inventores han mostrado que, marcando células con proteína de la cubierta E2 recombinante, es posible clasificar las células usando citometría de flujo, aislando las células capaces de unirse de forma específica a E2 y, por tanto, potencialmente portadoras de un receptor del VHC.

En la solicitud de patente internacional en tramitación PCT/IB96/00943 (documento WO 97/09343), los inventores han identificado una proteína capaz de unirse a la proteína de la cubierta E2 del VHC.

En la actualidad, los inventores han tenido éxito, con algunas dificultades, en la clonación del ADN que codifica el receptor del VHC y han descubierto, sorprendentemente, que el ADN codifica una proteína celular conocida como CD81. Los inventores no conocen ninguna asociación en la bibliografía entre el CD81 y el VHC. El CD81 se identificó primero con anticuerpos monoclonales como la diana de un anticuerpo antiproliferación (TAPA-1) que inhibía la proliferación celular in vitro. Armados con esta nueva información y dado el conocimiento de la secuencia del CD81 en las bases de datos públicas, ahora es posible diseñar y producir un armamento de reactivos terapéuticos y diagnósticos contra el VHC.

De acuerdo con la invención, se proporciona un fragmento EC2 de la proteína CD81, que consta de los aminoácidos 113-201 de la secuencia de CD81 humano enumerado en la base de datos SWISSPROT (nº de registro P18582) o la base de datos EMBL/GENBANK (nº de registro M33680), o que tiene, al menos, una homología del 80% con los aminoácidos 113-201 de la secuencia de CD81 humana, en la que la homología se define usando el paquete de software de análisis de secuencia Pileup (Wisconsin, 1996), para usar en el tratamiento o diagnóstico de la infección por VHC.

El término "proteína CD81" o un equivalente funcional de la misma, como se usa en la presente memoria descriptiva, quiere decir la proteína CD81 definida por la secuencia proteica enumerada en la base de datos SWISSPROT (nº de registro P18582) o en la base de datos EMBL/GENBANK (nº de registro M33680) o un equivalente funcional de la misma. Un equivalente funcional de CD81 es un compuesto que es capaz de unirse al VHC, preferentemente a la proteína E2 del VHC. Preferentemente, el equivalente funcional es un péptido o proteína. El término "equivalente funcional" incluye un análogo de CD81, un fragmento de CD81 y mutantes y muteínas de CD81.

Una región de la proteína CD81 humana que en la presente memoria descriptiva se muestra que participa en la unión a la proteína E2 del VHC es la región "EC2", que comprende los aminoácidos 113-201 de toda la longitud de la secuencia humana que se muestra en la figura 1. La invención describe proteínas y fragmentos de proteínas que contienen esta región de CD81 humana o que contienen equivalentes funcionales de esta región, tales como, por ejemplo, la secuencia de chimpancé identificada en la figura 1. Preferentemente, el equivalente funcional tiene una homología de al menos un 80% con la secuencia de CD81 humana en la región EC2 de la proteína, preferentemente de al menos un 90% de homología evaluada mediante cualquier algoritmo de análisis convencional, tal como, por ejemplo, el software de análisis de secuencia Pileup (Manual de programa para el paquete Wisconsin, 1996).

La expresión "un fragmento funcionalmente equivalente", como se usa en la presente memoria descriptiva, quiere decir cualquier fragmento o ensamblaje de fragmento de la proteína completa que se une al VHC, preferentemente que se une a la proteína E2 del VHC. La proteína completa puede estar fragmentada en uno o ambos extremos o se pueden eliminar dominios internamente siempre que la proteína conserve la función definida. Por ejemplo, pueden eliminarse una o más regiones de la proteína responsable de la unión a la membrana (TM1 a TM4 en la figura 1) para convertir a la proteína en soluble cuando se produce mediante un proceso recombinante. El fragmento de elección comprende el bucle extracelular 2 (EC2 en la figura 1) de la proteína CD81 (aminoácidos 113-201).

En caso de proteináceos, fragmentos o análogos funcionalmente equivalentes pueden pertenecer a la misma familia de proteínas que la proteína CD81 humana identificada en la presente memoria descriptiva. Por "familia de proteínas" se quiere decir un grupo de proteínas que comparten una función común y exhiben una homología de secuencia común, Por homología de secuencia se quiere decir que las secuencias de proteínas están relacionadas por divergencia a partir de un ascendente común, como es el caso entre el ser humano y el chimpancé. Por tanto, la CD81 de chimpancé es un ejemplo de proteína funcionalmente equivalente que se une al VHC.

La homología entre secuencias proteicas funcionalmente equivalentes es de al menos un 80% en toda la secuencia de aminoácidos de la proteína completa o del fragmento EC2 completo (aminoácidos 113-201).

La expresión "un análogo funcionalmente equivalente" se usa para describir los compuestos que poseen una función análoga a una actividad de la proteína CD81 y puede, por ejemplo, comprender un péptido, péptido cíclico, polipéptido, anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Estos compuestos pueden ser proteínas o pueden ser agentes sintéticos diseñados de modo que imiten ciertas estructuras o epítopos sobre la proteína inhibidora. Preferentemente, el compuesto es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

La expresión "análogo funcionalmente equivalente" también incluye cualquier análogo de CD81 obtenido mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos mediante, por ejemplo, una o más deleciones, sustituciones o adiciones de aminoácidos, de modo que el análogo de la proteína conserva la capacidad para unirse al VHC, preferentemente a la proteína E2 del VHC. Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse mediante, por ejemplo, mutación puntual del ADN que codifica la secuencia de aminoácidos.

El equivalente funcional de CD81 puede ser un análogo o fragmento de CD81. La CD81 o equivalente funcional pueden modificarse químicamente a condición de que conserve su capacidad para unirse al VHC, preferentemente la proteína E2 del VHC.

Se ha previsto que dichas moléculas sean extremadamente útiles en el tratamiento preventivo de la infección por VHC, porque estas moléculas se unirán específicamente al virus y, por tanto, se evitará la internalización del virus en las células. Como se usa en la presente memoria descriptiva,...

1. Un fragmento EC2 de la proteína CD81, que consta de los aminoácidos 113-201 de la secuencia de CD81 humano enumerado en la base de datos SWISSPROT (nº de registro P18582) o la base de datos EMBL/GENBANK (nº de registro M33680), o que tiene, al menos, una homología del 80% con los aminoácidos 113-201 de la secuencia de CD81 humana, en la que la homología se define usando el paquete de software de análisis de secuencia Pileup (Wisconsin, 1996), para usar en el tratamiento o diagnóstico de la infección por VHC.

2. Un fragmento de acuerdo con la reivindicación 1, que es un análogo funcionalmente equivalente de CD81 obtenido mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos mediante deleciones, sustituciones o adiciones de uno o más aminoácidos, de modo que el análogo de la proteína conserva la capacidad para unirse a la proteína E2 del VHC, para su uso en el tratamiento o diagnóstico de la infección por VHC.

3. Una composición farmacéutica que comprende un fragmento de una proteína CD81 de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, opcionalmente como una sal farmacéuticamente aceptable, en combinación con un transportador farmacéuticamente aceptable.

4. Un procedimiento para preparar una composición farmacéutica según se define en la reivindicación 3, en la que un fragmento de una proteína CD81 se pone en asociación con un transportador farmacéuticamente aceptable.

5. Uso de un fragmento de una proteína CD81 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o diagnóstico de una infección por VHC.

6. Un ensayo para anticuerpos del VHC presentes en una muestra de suero, que comprende la etapa de permitir la unión competitiva entre los anticuerpos en la muestra, una cantidad conocida de proteína del VHC y una cantidad conocida de un fragmento de una proteína CD81 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y medir la cantidad de la proteína conocida del VHC que se une al fragmento de la proteína CD81.

7. Un ensayo para el VHC en una muestra de suero, que comprende la etapa de permitir la unión competitiva entre los anticuerpos en la muestra y una cantidad conocida de un fragmento de una proteína CD81 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y medir la cantidad de la proteína CD81 unida conocida.

8. Un kit diagnóstico que comprende un fragmento de una proteína CD81 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, opcionalmente marcado.

9. Un kit diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el marcador comprende un marcador radioactivo, un péptido, un epítopo, una enzima u otro compuesto bioactivo.

10. Un procedimiento para la detección selectiva de compuestos químicos según su capacidad para unirse a la región del VHC responsable de la unión a una célula huésped, que comprende medir la unión de un compuesto químico que se va a someter a detección selectiva a un fragmento de una proteína CD81 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

11. Un ratón transgénico, que porta un transgen que codifica un fragmento de una proteína CD81 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

12. Un procedimiento para producir un ratón transgénico, que comprende la etapa de introducir en el embrión de un ratón un ADN que codifica un fragmento de una proteína CD81 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

13. Una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de una proteína CD81 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para su uso en el tratamiento o diagnóstico de la infección por VHC.

14. Una molécula de ácido nucleico que hibrida con una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 13 en condiciones restrictivas elevadas (2 x ssc, 65ºC) para su uso en el tratamiento o diagnóstico de la infección por VHC.

15. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 13 o la reivindicación 14, que comprende ADN.

16. Un fragmento de una proteína CD81 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para su uso como inmunógeno protector en el control de infección por VHC.

17. Una proteína de fusión que comprende un fragmento de una proteína CD81, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para su uso en el tratamiento o diagnóstico de infección por VHC.