Anticuerpo CD20 anti-humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo,

donde el anticuerpo comprende la secuencia VH de SEC ID No. 8 mostrada en la figura 1B (2H7.v16) y la secuencia VL de SEC ID No. 2 mostrada en la figura 1A (2H7.v16)

Variantes de inmunoglobulina y sus utilizaciones.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-CD-20 y su utilización en el tratamiento de enfermedades relacionadas con las células B.

Antecedentes de la invención

Los linfocitos son una de las diversas poblaciones de glóbulos blancos; reconocen específicamente y responden a antígenos extraños. Las tres clases principales de linfocitos son los linfocitos B (células B), linfocitos T (células T) y células "asesinas" naturales (NK). Los linfocitos B son las células responsables para la producción de anticuerpos y proporcionan inmunidad humoral. Las células B maduran en la médula ósea y dejan la médula expresando un anticuerpo de unión a antígeno en su superficie celular. Cuando una célula B intacta se encuentra primero con el antígeno por el que su anticuerpo unido a membrana es específico, la célula empieza a dividirse rápidamente y su progenie a diferenciarse en células B de memoria y células efectoras denominadas "células plasmáticas". Las células B de memoria presentan un tiempo de vida más largo y continua para expresar el anticuerpo unido a membrana con la misma especificidad que la célula parental original. Las células plasmática no producen anticuerpo unido a membrana, sino que en cambio producen la forma secretada del anticuerpo. Los anticuerpos secretados son las moléculas efectoras principales de la inmunidad humoral.

El antígeno CD20 (también denominado antígeno de diferenciación limitado a linfocitos B humanos, Bp35) es una proteína transmembrana hidrofóbica con un peso molecular de aproximadamente 35 kD situada en pre-linfocitos B y linfocitos B maduros (Valentine et al. J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989); y Einfeld et al. EMBO J. 7(3):711-717 (1988)). El antígeno también se expresa en más del 90% de los linfomas no de Hodgkin (NHL) de células B (Anderson et al. Blood 63(6): 1424-1433 (1984)), pero no se encuentra en células madre hematopoyéticas, pro-células B, células plasmáticas normales u otros tejidos normales. (Tedder et al. J. Immunol. 135(2):973-979 (1985)). Se cree que D20 regula una etapa o etapas tempranas en el proceso de activación para el inicio del ciclo celular y la diferenciación (Tedder et al., supra) y posiblemente funciona como canal de iones de calcio (Tedder et al. J. Cell. Biochem. 14D:195 (1990)).

Dada la expresión de Cd20 en linfomas de células B, este antígeno ha sido una diana terapéutica útil para tratar dichos linfomas. Hay más de 300.000 personas en los Estados Unidos con NHL de células B y se diagnostican cada año más de 56.000 nuevos casos. Por ejemplo, el anticuerpo rituximab (RITUXAN®) que es un anticuerpo monoclonal murino/humano quimérico diseñado genéticamente dirigido contra el antígeno CD20 humano (disponible comercialmente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, U.S.) se utiliza para el tratamiento de pacientes con un linfoma no de Hodgkin de células B, positivas de CD20, de grado bajo o folicular recidivante o refractario. Rituximab es el anticuerpo referido como "C2B8" en la Patente de Estados Unidos No. 5,736,137 concedida el 7 de abril de 1998 (Anderson et al.) y en la Patente de Estados Unidos No. 5,776,456. El mecanismo in vitro de estudios de acción han demostrado que el RITUXAN® se une al complemento humano y lisa líneas de células B linfoides a través de la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) (Reff et al. Blood 83(2):435-445 (1994)). Adicionalmente, tiene una actividad significativa en pruebas para la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Los estudios preclínicos in vivo han mostrado que el RITUXAN® reduce las células B de la sangre periférica, nódulos linfáticos y médula ósea de monos cynomolgus, presumiblemente a través de complemento y procesos mediados por células (Reff et al. Blood 83(2):435-445 (1994)). Otros anticuerpos anti-CD20 indicados para el tratamiento de NHL incluyen el anticuerpo murino Zovalin^TM que está unida al radioisótopo, Ytrio-90 (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA), Bexxar^TM que es otro anticuerpo totalmente murino conjugado a I-131 (Corixa, WA).

Una limitación principal en la utilización de anticuerpos murinos en terapia humana es la respuesta del anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) (véase, por ejemplo, Miller, R.A. et al. "Monoclonal antibody therapeutic trials in seven patients with T-cell lymphoma" Blood, 62:988-995, 1983; and Schroff, R.W., et al. "Human anti-murine immunoglobulin response in patients receiving monoclonal antibody therapy" Cancer Res. 45:879-885, 1985). El documento US 5 576 195 describe un anticuerpo anti-CD20 quimérico con CDRs representadas como SEC ID Nos. 4, 5, 6 y 10, 11 y 12 tal como se describen aquí. Incluso las moléculas quiméricas, donde los dominios variables (V) de anticuerpos de roedores se fusionan a regiones constantes (C) humanas son capaces de producir una respuesta inmune significativa (HACA, anticuerpos humano anti-quimérico) (Neuberger et aL Nature (Lond.), 314:268-270, 1985). Una estrategia potente para superar estas limitaciones en el uso clínico de anticuerpos monoclonales es la "humanización" del anticuerpo murino o anticuerpo de una especie no humana (Jones et al. Nature (Lond), 321:522-525,1986; Riechman et al., Nature (Lond), 332:323-327, 1988).

De este modo, es ventajoso producir anticuerpos terapéuticos para el antígeno CD20 que crean una antigenicidad mínima o nula cuando se administran a los pacientes, especialmente para el tratamiento crónico. La presente invención satisface ésta y otras necesidades. La presente invención proporciona anticuerpos anti-CD20 que superan las limitaciones de las composiciones terapéuticas actuales y ofrece ventajas adicionales que serán evidentes a partir de la descripción detallada siguiente.

Descripción resumida de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos de unión a CD20 anti-humanos o fragmentos funcionales de los mismos tal como se establece en la reivindicación 1, y se refiere a su uso en el tratamiento de enfermedades asociadas con células B. Estos anticuerpos son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos anti-CD20 descritos aquí pueden comprender además cambios en los residuos de aminoácidos en la región Fc que conducen a una función efectora mejorada incluyendo una función CDC y/o ADCC mejoradas y la eliminación de las células B (también se refiere aquí como reducción de células B). Los anticuerpos anti-CD20 de la invención incluyen aquellos que tienen cambios específicos que mejoran la estabilidad. Las variantes 2H7 humanizadas con mayor estabilidad se describen en el ejemplo 6 siguiente. En la presente invención se describen variantes deficientes en fucosa con una función ADCC mejorada in vivo están descritos aquí.

En una realización preferida de todas de las composiciones de anticuerpos y los métodos de uso de la presente invención, el anticuerpo de unión CD20 humanizado es 2H7.v16 que tiene la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de SEC ID NO. 21 y 22 respectivamente, tal como se muestra en la Figura 6 y la Figura 7. Cuando se hace referencia a las secuencias de polipéptido en las Figuras 6, 7 y 8, debe entenderse que los primeros 19 o aproximadamente 19 aminoácidos que forman la secuencia señal secretora no están presentes en el polipéptido maduro. La región V de otras variantes basada en la versión 16 tendrá las secuencias de aminoácidos de v16 excepto de las posiciones de las sustituciones de aminoácidos que se indican en la descripción. A menos que se indique lo contrario, las variantes 2H7 tendrán la misma cadena L que la de v16.

La presente invención proporciona un anticuerpo humanizado que se une a CD20 humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se establece en las reivindicaciones, donde el anticuerpo es efectivo para reducir la células B de primate in vivo. En una realización, las células B de primate son de mono Cynomolgus y de humano.

El anticuerpo de la presente invención comprende la secuencia V_H de SEC ID NO.8 de v16, tal como se muestra en la Figura 1B y la secuencia V_L de SEC ID NO.2 de v16, tal como se muestra en la Figura 1A.

En otras realizaciones, el anticuerpo humanizado es 2H7 v.31 que tiene la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de SEC ID NO. 21 y 23, respectivamente, tal como se muestra en la Figura 6 y la Figura 8; 2H7 v.31 que tiene la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de...

1. Anticuerpo CD20 anti-humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo, donde el anticuerpo comprende la secuencia VH de SEC ID No. 8 mostrada en la figura 1B (2H7.v16) y la secuencia VL de SEC ID No. 2 mostrada en la figura 1A (2H7.v16).

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde la región VH está unida a una región constante de cadena de IgG humana.

3. Anticuerpo según la reivindicación 2, donde la IgG humana es IgG1 o IgG3.

4. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de cadena ligera y pesada de la SEC ID No. 21 mostrada en las figuras 6 y 22 y en la figura 7, respectivamente.

5. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de cadena ligera y pesada de la SEC Id No. 21 mostrada en las figuras 6 y 23 y en la figura 8, respectivamente.

6. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según la reivindicación 1, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es eficaz para reducir las células B de primate in vivo y las células B de primate son de humano y mono Cynomolgus.

7. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones anteriores conjugado a un agente citotóxico.

8. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según la reivindicación 7, donde el agente citotóxico es un isótopo radioactivo o una toxina.

9. Anticuerpo CD20 anti-humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo, cuyo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se produce mediante un método de expresión de un ácido nucleico que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en una célula huésped y la recuperación de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno producidos a partir del cultivo de células huésped.

10. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 9, donde la célula huésped es una célula CHO.

11. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, donde el ácido nucleico codifica el anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera o pesada de SEC ID NO. 21 mostrada en las figuras 6 y 22 y en la Figura 7, respectivamente.

12. Composición que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de cualquiera según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y un portador.

13. Composición de la reivindicación 12, donde el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera o pesada de SEC ID NO. 21 mostrada en las Figuras 6 y 22 y en la Figura 7, respectivamente, y el portador es un portador farmacéuticamente aceptable.

14. Artículo de fabricación que comprende un recipiente y una composición contenida en el mismo, donde la composición comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones de 1-11.

15. Artículo de fabricación de la reivindicación 14, que comprende además un prospecto que indica que la composición se puede utilizar para tratar el linfoma no de Hodgkin o artritis reumatoide.

16. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 11 para su uso en un método de inducción de apoptosis en células B in vivo, un método de tratamiento de un cáncer positivo de CD20 en un paciente, o un método de tratamiento de una enfermedad autoinmune en un paciente.

17. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 16, donde el cáncer positivo de CD20 es un linfoma o leucemia de células B.

18. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 17, donde el cáncer positivo de CD20 es un linfoma no de Hodgkin (NHL) o enfermedad de Hodgkin predominante de linfocitos (LPHD).

19. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 16, donde el cáncer es leucemia linfocítica crónica o linfoma linfocítico pequeño.

20. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según una de las reivindicaciones 16 a 19, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración para tratar un cáncer positivo de CD20 en un paciente en un intervalo de dosis de aproximadamente 275-375 mg/m².

21. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según una de las reivindicaciones 16 a 19, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración para tratar un cáncer positivo de CD20 en un paciente en un intervalo de dosis entre aproximadamente 250 mg/m² y aproximadamente 500 mg/m².

22. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según una de las reivindicaciones 16 a 21, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para administrar al paciente para tratar un cáncer positivo de CD20 con por lo menos un agente quimioterapéutico.

23. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 22, donde el cáncer es un linfoma no de Hodgkin (NHL) y el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisolona y CHOP.

24. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 20, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración para tratar un cáncer positivo de CD20 en un paciente en por lo menos dos dosis de 375 mg/m² por dosis.

25. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 24, donde las dos dosis tienen dos semanas de diferencia.

26. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 16, donde la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, lupus eritematoso sistémico (SLE), nefritis de lupus, colitis ulcerosa, enfermedad de Wegener, enfermedad intestinal inflamatoria, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia autoinmune, esclerosis múltiple, psoriasis, nefropatía de IgA, polineuropatías de IgM, miastenia gravis, vasculitis, vasculitis ANCA, rechazo de transplante de órganos sólidos, enfermedad de injerto contra huésped, diabetes mellitus, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjorgen y glomerulonefritis.

27. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 26, donde la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide.

28. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 27, donde el paciente padece de artritis reumatoide de moderada a severa y el tratamiento con por lo menos un fármaco antireumático modificador de la enfermedad no fue satisfactorio.

29. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 27, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración al paciente para tratar la enfermedad autoinmune con un segundo agente terapéutico.

30. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 29, donde el segundo agente terapéutico es un agente inmunosupresor.

31. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 30, donde el agente inmunosupresor es metotrexato.

32. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 27, donde el anticuerpo de unión a CD20 o fragmento de unión a antígeno comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y pesada de SEC ID No. 21 mostrada en las figuras 6 y 22 y en la figura 7, respectivamente, y donde el anticuerpo es para la administración para tratar una enfermedad autoinmune en una dosis seleccionada entre 2x50 mg, 2x 200 mg y 2x500 mg.

33. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 32, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración mediante infusión intravenosa.

34. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 32, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración mediante administración subcutánea.

35. Ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

36. Vector de expresión que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

37. Célula huésped que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 35.

38. Célula huésped según la reivindicación 37 que produce un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a CD20 humano.

39. Célula huésped según la reivindicación 38 que es una célula CHO.

40. Método de producción de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a CD20 humano, que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 38 o la reivindicación 39 y recuperar el anticuerpo del cultivo celular.

41. Formulación líquida que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo a 20 mg/mL, sulfato de histidina 10 mM a pH 5,8, sacarosa 60 mg/ml, y polisorbato 20 0,2 mg/ml, donde el anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos de cadena ligera y pesada de SEC ID No. 21 mostrada en las figuras 6 y 22 y mostrada en la figura 7, respectivamente.

42. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 26, donde el anticuerpo de unión a CD20 comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y cadena pesada de la SEC ID No. 21 mostrada en las figuras 6 y 22 y en la figura 7, respectivamente.

43. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 42, donde la enfermedad autoinmune es el lupus eritematoso sistémico (SLE) o nefritis de lupus.

44. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 42, donde la enfermedad autoinmune es colitis ulcerosa.

45. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 42, donde la enfermedad autoinmune es vasculitis ANCA.

46. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 42, donde la enfermedad autoinmune es el rechazo del transplante de órganos sólidos o la enfermedad de injerto contra huésped.

47. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 42, donde el anticuerpo es para la administración mediante infusión intravenosa.

48. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 42, donde el anticuerpo o fragmento de unión a anticuerpo es para la administración mediante administración subcutánea.

49. Utilización del anticuerpo de unión a CD20 o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en la fabricación de un medicamento para tratar un cáncer positivo de CD20 en un paciente.

50. Utilización según la reivindicación 49, donde el cáncer positivo de CD20 es un linfoma o leucemia de células B.

51. Utilización según la reivindicación 49, donde el cáncer positivo de CD20 es el linfoma no de Hodgkin (NHL) o enfermedad de Hodgkin predominante de linfocitos (LPHD).

52. Utilización según la reivindicación 50, donde el cáncer es leucemia linfocítica crónica o linfoma linfocítico pequeño.

53. Utilización según la reivindicación 49, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración para tratar un cáncer positivo de CD20 en un paciente en una intervalo de dosis de aproximadamente 275-375 mg/m².

54. Utilización según la reivindicación 49, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración para tratar un cáncer positivo de CD20 en un paciente en una intervalo de dosis de aproximadamente 250 mg/m² a aproximadamente 500 mg/m².

55. Utilización según la reivindicación 53, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración para tratar un cáncer positivo de CD20 en un paciente en por lo menos dos dosis de 375 mg/m² por dosis.

56. Utilización según la reivindicación 55, donde las dos dosis están separadas dos semanas.

57. Utilización según la reivindicación 49, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración al paciente para tratar un cáncer positivo de CD20 con por lo menos un agente quimioterapéutico.

58. Utilización según la reivindicación 57, donde el cáncer es linfoma no de Hodgkin (NHL) y el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisolona, y CHOP.

59. Utilización del anticuerpo de unión a CD20 o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad autoinmune en un paciente.

60. Utilización según la reivindicación 59, donde la enfermedad autoimmune se selecciona del grupo que consiste en arthritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, lupus eritematoso sistémico (SLE), nefritis de lupus, colitis ulcerosa, enfermedad de Wegener, enfermedad de intestino inflamado, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopéncia trombótica (TTP), trombocitopenia autoinmune, esclerosis múltiple, psoriasis, nefropatía de IgA, polineuropatías de IgM, miastenia gravis, vasculitis, vasculitis ANCA, rechazo del transplante de órganos sólidos, enfermedad de injerto contra huésped, diabetes mellitus, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjorgen y glomerulonefritis.

61. Utilización según la reivindicación 60, donde la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide.

62. Utilización según la reivindicación 61, donde el paciente padece de arthritis reumatoide de moderada a severa y el tratamiento con por lo menos un fármaco antireumático modificador de la enfermedad no fue satisfactorio.

63. Utilización según la reivindicación 61, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración al paciente para tratar la enfermedad autoinmune con un segundo agente terapéutico.

64. Utilización según la reivindicación 63, donde el segundo agente terapéutico es un agente inmunosupresor.

65. Utilización según la reivindicación 64, donde el agente inmunosupresor es metotrexato.

66. Utilización según al reivindicación 61, donde el anticuerpo de unión a CD20 o fragmento de unión a antígeno comprende la secuencia de aminoácidos de cadena ligera y cadena pesada de la SEC ID No. 21 mostrada en las figuras 6 y 22 y mostrada en la figura 7, respectivamente, y donde el anticuerpo es para la administración para tratar una enfermedad autoinmune en una dosis seleccionada entre 2x50 mg, 2x 200 mg y 2x500 mg.

67. Utilización según la reivindicación 66, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración mediante infusión intravenosa.

68. Utilización según la reivindicación 66, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración mediante inyección subcutánea.