Anticuerpo anti-CD20 de tipo II glucomanipulado humanizado que presenta una ADCC incrementada como resultado de dicha glucomanipulación y que presenta una capacidad incrementa de inducir apoptosis de células diana tras dicha humanización,

en donde dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDRs) del anticuerpo B-Ly1 murino, en el que:

a. la CDR1 de la cadena pesada es la secuencia SEC ID nº 16,

b. la CDR2 de la cadena pesada es la secuencia SEC ID nº 26, y

c. la CDR3 de la cadena pesada es la secuencia SEC ID nº 28,

en donde las regiones marco (FRs) de la región variable de cadena pesada, FR1, FR2 y FR3 de dicho anticuerpo son secuencias FR humanas codificadas por la secuencia VH1_10 de la línea germinal humana y la región variable FR4 de cadena pesada de dicho anticuerpo es una secuencia FR humana codificada por la secuencia JH4 de la línea germinal humana, y

en donde dicho anticuerpo comprende además una región variable de cadena ligera que comprende las CDRs del anticuerpo B-Ly1 murino, en donde:

d. la CDR1 de la cadena ligera es la secuencia SEC ID nº 18,

e. la CDR2 de la cadena ligera es la secuencia SEC ID nº 19, y

f. la CDR3 de la cadena ligera es la secuencia SEC ID nº 20,

en donde las FRs de la región variable de la cadena ligera FR1, FR2 y FR3 de dicho anticuerpo son secuencias FR humanas codificadas por la secuencia VK_2_40 de la línea germinal humana y la región FR4 de la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo es una secuencia FR humana codificada por la secuencia JK4 de la línea germinal humana

Anticuerpos CD20 con afinidad de unión a receptores Fc y función efectora incrementadas.

Antecedentes de la presente invención

La presente invención se refiere a moléculas de unión a antígeno (ABMs). En realizaciones particulares, la presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales recombinantes, es decir anticuerpos humanizados específicos para CD20 humana. Asimismo, la presente invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos codificantes de dichas ABMs y a vectores y células huésped que comprenden dichas moléculas de ácidos nucleicos. La invención se refiere asimismo a métodos para producir las ABMs de la invención y a métodos de utilización de dichas ABMs en el tratamiento de enfermedades. Además, la presente invención se refiere a ABMs con glucosilación modificada que presentan propiedades terapéuticas mejoradas, incluyendo anticuerpos con una capacidad incrementada de unión a receptores Fc y con una función efectora incrementada.

El sistema inmunológico de los vertebrados, incluido el ser humano, consiste de varios órganos y tipos celulares, que han evolucionado para reconocer, unirse y destruir exacta y específicamente los microorganismos foráneos invasores ("antígenos"). Los linfocitos resultan críticos para la función correcta del sistema inmunológico. Estas células se producen en el timo, el bazo y la médula ósea (adulta) y representan aproximadamente 30% de los glóbulos blancos totales presentes en el sistema circulatorios del ser humano adulto. Existen dos subpoblaciones importantes de linfocitos: las células T y las células B. Las células T son responsables de la inmunidad mediada por células, mientras que las células B son responsables de la producción de anticuerpos (inmunidad humoral). Sin embargo, en una respuesta inmunológica típica, las células T y las células B funcionan independientemente. Las células T son activadas al unirse el receptor de células T a fragmentos de un antígeno que se encuentran unidos a glucoproteínas del complejo de histocompatibilidad mayor ("MHC") sobre la superficie de una célula presentadora de antígenos; esta activación provoca la liberación de mediadores biológicos ("interleuquinas"), que estimulan a las células B a diferenciarse y producir anticuerpos ("inmunoglobulinas") contra el antígeno.

Cada célula B dentro del huésped expresa un anticuerpo de un tipo y especificidad particulares, y diferentes células B expresan anticuerpos específicos para diferentes antígenos. La proliferación de las células B y la producción de anticuerpos alcanzan un máximo como reacción a un foráneo antígeno, y típicamente ambos cesan (o se reducen sustancialmente) tras neutralizar el antígeno foráneo. Ocasionalmente, sin embargo, la proliferación de una célula B particular puede continuar sin control; dicha proliferación puede resultar en un cáncer denominado "linfoma de células B".

Tanto las células T como las células B comprenden proteínas de superficie celular que pueden utilizarse como "marcadores" para la diferenciación e identificación. Una de estas células B humanas marcadoras es el antígeno Bp35 de diferenciación restringido a linfocitos D, denominado "CD20". CD20 se expresa durante el desarrollo temprano de las células pre-B y permanece hasta la diferenciación de la célula plasmática. Específicamente, la molécula CD20 podría regular una etapa en el proceso de activación que resulta necesaria para el inicio y diferenciación del ciclo celular, y habitualmente se expresa a niveles muy altos en las células B neoplásicas ("tumorales"). Debido a que CD20 se encuentra presente a niveles elevados sobre células B "malignas", es decir, aquellas células B cuya proliferación no controlada puede conducir a un linfoma de células B, el antígeno de superficie CD20 presenta el potencial de servir como candidato para el "reconocimiento" de los linfomas de células B.

En esencia, dicho reconocimiento puede generalizarse de la manera siguiente: se introducen anticuerpos específicos del antígeno de superficie CD20 de las células B en un paciente, mediante inyección, por ejemplo. Estos anticuerpos anti-CD20 se unen específicamente al antígeno de superficie celular CD20 de, aparentemente, células normales y células B malignas; el anticuerpo anti-CD20 unido al antígeno de superficie CD20 puede conducir a la destrucción y marcada reducción de las células B neoplásicas. Además, algunos agentes químicos o marcajes radioactivos que presentan el potencial de destruir el tumor pueden conjugarse con el anticuerpo anti-CD20 de manera que el agente se "administre" específicamente a, por ejemplo, las células B neoplásicas. Con independencia del enfoque, un objetivo principal es destruir el tumor: el enfoque específico puede ser determinado por el anticuerpo anti-CD20 particular que se utilice y, de esta manera, los enfoques disponibles para el reconocimiento del antígeno CD20 pueden variar considerablemente.

Los anticuerpos monoclonales (mAbs) no conjugados pueden ser medicinas útiles para el tratamiento del cáncer, tal como demuestra la autorización de la U.S. Food and Drug Administration del Rituximab (Rituxan^TM; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA, y Genentech Inc., San Francisco, CA) para el tratamiento de células B CD20-positivas, linfoma no de Hodgkin folicular o de grado bajo, trastuzumab (Herceptin^TM, Genentech Inc.), para el tratamiento del cáncer de mama avanzado (Grillo-Lopez, A.-J. et al., Semin. Oncol. 26:66-73, 1999; Goldenberg M.M., Clin Ther. 21:309-18, 1999), Gemtuzumab (Mylotarg^TM, Celltech/Wyeth-Ayerst) para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda en recaída, y Alemtuzumab (CAM-PATH^TM, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica de células B. El éxito de estos productos se basa no sólo en su eficacia, sino también en sus excepcionales perfiles de seguridad (Grillo-Lopez A.-J. et al., Semin. Oncol. 26:66-73, 1999; Goldenberg M.M., Clin. Ther. 21:309-18, 1999). A pesar de los éxitos obtenidos con estos fármacos, en la actualidad existe un gran interés en obtener una actividad específica más alta de anticuerpo que la proporcionada típicamente por la terapia de mAb no conjugado. El anticuerpo monoclonal murino B-Ly1 es otro anticuerpo que es conocido que es específico de el CD20 humano (Poppema S. y Visser L., Biotest Bulletin 3:131-139, 1987).

La patente WO nº 03/11878 describe la glucomanipulación de anticuerpos utilizando C2B8 (Rituxan) a título de ejemplo, Dicho documento no contiene ninguna mención de B-Ly1.

Polyak et al., 2002, páginas 3256 a 3262, estudiaron el epítopo o epítopos a los que se unen diversos anticuerpos anti-CD20. Utilizaron un B-Ly1 totalmente murino como uno de entre un panel de 16 anticuerpos en experimentos para analizar la reactividad con una región particular del bucle extracelular de CD20, y la capacidad de inducir la agregación homotípica de las células y de traslocar CD20 a la membrana celular. Sin embargo, no proporcionaron ninguna secuencia de B-Ly1 ni construyeron proteínas de fusión que comprendiesen partes de la secuencia de B-Ly1, tales como anticuerpos quiméricos, humanizados o glucomanipulados, que conservasen la capacidad de unirse a CD20.

Cragg et al., Blood, 2003, páginas 1045 a 1052, correlacionaron la lisis mediada por el complemento con diversos anticuerpos anti-CD20, incluyendo el Rituximab, con la segregación de CD20 en balsas lipídicas. Cragg et al. no sometieron a ensayo ni siquiera el anticuerpo B-Ly1 totalmente murino en su estudio; por el contrario, meramente hacen referencia al artículo de Polyak y Deans, que indicaba que B-Ly1 no libera CD20 en balsas lipídicas.

Davies et al., Biotechnology and Bioengineering - Combinatorial Chemistry, 2001, páginas 288 a 294, expresaron GnTIII de rata en células CHO que expresaban Rituximab. Ni siquiera mencionan el B-Ly1 murino, así como tampoco construyeron polipéptidos de fusión que comprendiesen secuencias de B-Ly1 o anticuerpos de tipo II glucomanipulados.

La patente US nº 2003/67796 se refiere a métodos para tratar enfermedades autoinmunológicas con antagonistas que se unen a marcadores de la superficie de las células B (por ejemplo anticuerpos anti-CD20). Los ejemplos se refieren al Rituximab. No se da a conocer el anticuerpo de B-Ly1.

Los resultados de varios estudios sugieren que los mecanismos dependientes...

1. Anticuerpo anti-CD20 de tipo II glucomanipulado humanizado que presenta una ADCC incrementada como resultado de dicha glucomanipulación y que presenta una capacidad incrementa de inducir apoptosis de células diana tras dicha humanización, en donde dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDRs) del anticuerpo B-Ly1 murino, en el que:

a. la CDR1 de la cadena pesada es la secuencia SEC ID nº 16,

b. la CDR2 de la cadena pesada es la secuencia SEC ID nº 26, y

c. la CDR3 de la cadena pesada es la secuencia SEC ID nº 28,

en donde las regiones marco (FRs) de la región variable de cadena pesada, FR1, FR2 y FR3 de dicho anticuerpo son secuencias FR humanas codificadas por la secuencia VH1_10 de la línea germinal humana y la región variable FR4 de cadena pesada de dicho anticuerpo es una secuencia FR humana codificada por la secuencia JH4 de la línea germinal humana, y

en donde dicho anticuerpo comprende además una región variable de cadena ligera que comprende las CDRs del anticuerpo B-Ly1 murino, en donde:

d. la CDR1 de la cadena ligera es la secuencia SEC ID nº 18,

e. la CDR2 de la cadena ligera es la secuencia SEC ID nº 19, y

f. la CDR3 de la cadena ligera es la secuencia SEC ID nº 20,

en donde las FRs de la región variable de la cadena ligera FR1, FR2 y FR3 de dicho anticuerpo son secuencias FR humanas codificadas por la secuencia VK_2_40 de la línea germinal humana y la región FR4 de la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo es una secuencia FR humana codificada por la secuencia JK4 de la línea germinal humana.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de secuencia SEC ID nº 32 o SEC ID nº 40.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho anticuerpo comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de secuencia SEC ID nº 40.

4. Anticuerpo según las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho anticuerpo comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de región variable de cadena ligera de secuencia SEC ID nº 76.

5. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho anticuerpo comprende un primer polipéptido aislado que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de secuencia SEC ID nº 32 o SEC ID nº 40, y un segundo polipéptido aislado que comprende una secuencia de región variable de cadena ligera de secuencia SEC ID nº 76.

6. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho anticuerpo comprende un primer polipéptido aislado que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID nº 40, y un segundo polipéptido aislado que comprende una secuencia de región variable de cadena ligera de secuencia SEC ID nº 76.

7. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho anticuerpo ha sido glucomanipulado para que presente un incremento del número de residuos de fucosa.

8. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo ha sido glucomanipulado para presentar una reducción del número de residuos de fucosa.

9. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, presentando dicho anticuerpo una región Fc con oligosacáridos modificados.

10. Anticuerpo según la reivindicación 9, en donde por lo menos 20% de los oligosacáridos en la región Fc de dicho polipéptido son biantenarios no fucosilados.

11. Anticuerpo según la reivindicación 9, en donde por lo menos 50% de los oligosacáridos en la región Fc son no fucosilados.

12. Célula huésped que expresa por lo menos un ácido nucleico codificante de un polipéptido que presenta actividad de ß(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III en una cantidad suficiente para glucomanipular la región Fc de un polipéptido producido por dicha célula huésped, en donde dicho polipéptido es un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Célula huésped según la reivindicación 12, en donde dicho anticuerpo producido por dicha célula huésped muestra una afinidad de unión a receptores Fc incrementada como resultado de dicha glucomanipulación.

14. Célula huésped según la reivindicación 13, en donde dicho receptor Fc es el receptor Fc?RIIIA.

15. Célula huésped según la reivindicación 12, en donde dicho anticuerpo producido por dicha célula huésped muestra una función efectora incrementada como resultado de dicha glucomanipulación.

16. Célula huésped según la reivindicación 15, en donde dicha función efectora incrementada es la señalización directa inductora de apoptosis incrementada.

17. Célula huésped según la reivindicación 12, que comprende además por lo menos un polinucleótido transfectado codificante de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 5 ó 6, y en donde dicho ácido nucleico comprende una secuencia codificante de una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina humana.

18. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un portador farmacéuticamente aceptable.

19. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la utilización como medicamento destinado al tratamiento del linfoma de células B.

20. Utilización del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del linfoma de células B.