MOLÉCULAS DE UNIÓN A CD20.

La presente invención se refiere a moléculas de unión a CD20 y secuencias de ácido nucleico que codifican moléculas de unión a CD20. En particular, la presente invención se refiere a moléculas de unión a CD20 con una alta afinidad de unión, y una baja velocidad de disociación, con respecto a CD20 humana. Preferiblemente, las moléculas de unión a CD20 de la presente invención comprenden regiones variables de cadena ligera y/o pesada con regiones flanqueantes completamente humanas (por ejemplo, regiones flanqueantes de la línea germinal humana). Antecedentes de la invención Previamente se ha informado del uso de anticuerpos contra el antígeno CD20 como agentes de diagnóstico y/o terapéuticos para enfermedades tales como linfoma de células B. CD20 es un marcador o diana útil para linfomas de células B ya que este antígeno se expresa en muy altas densidades sobre la superficie de células B malignas, es decir, células B en las que la proliferación no moderada puede conducir a linfomas de células B. CD20 (también conocido como Bp35) es un antígeno de diferenciación restringido a linfocitos B que se expresa durante el desarrollo temprano pre-célula B y permanece hasta la diferenciación en células plasmáticas. Algunos creen que la molécula CD20 puede regular una etapa en el proceso de activación de células B que es necesaria para el inicio del ciclo celular y la diferenciación. Además, como se aprecia, CD20 se expresa habitualmente a niveles muy altos en células B neoplásicas ("tumorales"). El antígeno CD20 está solicitando una terapia dirigida, porque no se elimina, modula o internaliza. Las terapias presentadas previamente que implican anticuerpos anti CD20 han implicado la administración de un anticuerpo anti CD20 terapéutico sólo o junto con un segundo anticuerpo anti CD20 radiomarcado, o un agente quimioterapéutico. La Administración de Alimentos y Fármacos ha aprobado el uso terapéutico de uno de dichos anticuerpos anti CD20, RITUXAN para su uso en linfoma no Hodgkin (NHL) de bajo grado reincidente y previamente tratado. Sin embargo, aunque se ha informado del uso de RITUXAN generalmente como eficaz para tratar linfomas de células B, los pacientes tratados a menudo están sometidos a una recaída de la enfermedad. Más recientemente, se ensayó RITUXAN para la seguridad, tolerabilidad y eficacia clínica preliminar para el tratamiento de 18 pacientes con lupus sistémico eritematoso (SLE) (que son pacientes no inmunosuprimidos). Parte de los resultados de este estudio se presentaron en octubre de 2002 en la American College of Rheumatology (ACR) 66th Annual Scientific Meeting. De los 18 pacientes tratados, seis pacientes recibieron una infusión de RITUXAN a 100 mg/m 2 (dosis baja), seis pacientes recibieron una infusión de RITUXAN a 375 mg/m 2 (dosis media), y seis pacientes recibieron cuatro infusiones semanales de RITUXAN a 375 mg/m 2 (dosis alta). Tres de los 12 pacientes que recibieron la dosis baja o media (25%) desarrollaron elevados títulos antiquimera humano (HACA) a los dos meses, mientras que los pacientes con dosis alta aun se están evaluando. Por consiguiente, los que se necesita, son moléculas de unión a CD20 que tengan una alta afinidad de unión y baja constante de disociación de modo que los pacientes con linfoma de células B tratados no recaigan, y moléculas de unión a CD20 que no causen, o tengan un potencial reducido para causar, una reacción HACA cuando se administren a pacientes que no estén inmunosuprimidos. Sumario de la invención La presente invención proporciona moléculas de unión a CD20 y secuencias de ácido nucleico que codifican moléculas de unión a CD20. En particular, la presente invención proporciona moléculas de unión a CD20 con una alta afinidad de unión, y una baja velocidad de disociación, con respecto a CD20 humana. Preferiblemente, las moléculas de unión a CD20 de la presente invención comprenden regiones variables de cadena ligera y/o pesada con regiones flanqueantes completamente humanas (por ejemplo, regiones flanqueantes de la línea germinal humana). En algunas realizaciones, la presente invención proporciona composiciones que comprenden una molécula de unión a CD20, donde la molécula de unión a CD20 comprende: a) una región variable de cadena ligera, o una parte de una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena ligera (o la parte) comprende; i) un aminoácido CDRL1 de la SEC ID Nº 5; ii) una secuencia de aminoácidos CDRL2 de la SEC ID Nº 13; iii) una secuencia de aminoácidos CDRL3 de la SEC ID Nº 19, y b) una región variable de cadena pesada, o una parte de una región variable de cadena pesada, donde la región variable de cadena pesada (o la parte) comprende; i) una secuencia de aminoácidos CDRH1 de la SEC ID Nº 25; ii) una secuencia de aminoácidos CDRH2 de la SEC ID Nº 39; y iii) una secuencia de aminoácidos CDRH3 de la SEC ID Nº 57. En ciertas realizaciones, la región variable de cadena ligera comprende una parte una región flanqueante (por ejemplo, que contiene 2 ó 3 subregiones, tales como FR2 y FR3). En algunas realizaciones, la región variable de 2   cadena ligera comprende una región flanqueante completamente humana. En otras realizaciones, la región variable de cadena ligera comprende una región flanqueante de la línea germinal humana. En realizaciones particulares, la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 59. En ciertas realizaciones, la región variable de cadena pesada comprende una parte de una región flanqueante (por ejemplo, que contiene 2 ó 3 subregiones, tales como FR2 y FR3). En ciertas realizaciones, la región variable de cadena pesada comprende una región flanqueante completamente humana. En otras realizaciones, la región variable de cadena pesada comprende una región flanqueante de la línea germinal humana. En realizaciones adicionales, la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos 61. En algunas realizaciones, la molécula de unión a CD20 comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, Fv, Fab, etc.). En realizaciones particulares, la molécula de unión a CD20 comprende el Fv o Fab AME 33. En realizaciones particulares, la presente invención proporciona construcciones de fusión que comprenden una molécula de unión a CD20 (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) y un compañero de fusión, tal como una enzima, marcador detectable, molécula de carbohidrato, un lípido, etc. En algunas realizaciones, la construcción de fusión comprende un Fab o Fab'2 que se une a CD20 humano y una enzima para convertir un profármaco en una forma activa. En ciertas realizaciones, la molécula de unión a CD20 está contenida dentro de una célula huésped (por ejemplo, célula huésped eucariota o procariota). En otras realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena ligera y/o pesada está contenida dentro de un plásmido u otro vector de expresión. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona composiciones que comprenden una molécula de unión a CD20 que tiene una afinidad de unión (Kd) para CD20 humano de 5,0 x 10 -10 M o menos (por ejemplo, 5,0 x 10 -10 M - 5,0 x 10 -11 M). En otras realizaciones, la presente invención proporciona composiciones que comprenden una molécula de unión a CD20, donde la molécula de unión a CD20 tiene una afinidad de unión (Kd) para CD20 humano de 5,0 x 10 -10 M o menos, y una velocidad de disociación (koff) para CD20 humano de 5,0 x 10 -4 s -1 o menos. En realizaciones adiciones, la molécula de unión a CD20 tiene una afinidad de unión (Kd) para CD20 humano de 1,5 x 10 -10 M o menos. En algunas realizaciones, la molécula de unión a CD20 tiene una afinidad de unión (Kd) para CD20 humano de 1,0 x 10 -10 M o menos. En ciertas realizaciones, la molécula de unión a CD20 tiene una velocidad de disociación (koff) para CD20 humano de 2,5 x 10 -4 s -1 o menos. En realizaciones particulares, la molécula de unión a CD20 tiene una velocidad de disociación (koff) para CD20 humano de 1,0 x 10 -4 s -1 o menos (por ejemplo, 1,0 x 10 -4 s -1 - 1,0 x 10 -5 s -1 ). En algunas realizaciones, la molécula de unión a CD20 tiene una velocidad de disociación (koff) para CD20 humano de 8,0 x 10 -5 s -1 o menos. En realizaciones adicionales, la molécula de unión a CD20 tiene una velocidad de asociación (kon) para CD20 humano de 1,0 x 10 5 M -1 s -1 o mayor (por ejemplo, 1,0 x 10 5 M -1 s -1 - 1,0 x 10 6 M -1 s -1 ). En ciertas realizaciones, la molécula de unión a CD20 tiene una velocidad de asociación (kon) para CD20 humano de 5,0 x 10 5 M -1 s -1 o mayor. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos para tratar el linfoma de células B que comprende: a) proporcionar; i) un sujeto, y ii) una composición, donde la composición... [Seguir leyendo]

1.- Una composición que comprende una molécula de unión a CD20, en la que dicha molécula de unión a CD20 tiene una afinidad de unión (Kd) por CD20 humana de 5,0 x 10 -10 M o menos, y una velocidad de disociación (koff) para CD20 humana de 5,0 x 10 -4 s -1 o menos, en la que dicha molécula de unión a CD20 es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende: a) una región variable de cadena ligera, en la que dicha región variable de cadena ligera comprende; i) una secuencia de aminoácidos de CDRL1 de la SEC ID Nº 5; ii) una secuencia de aminoácidos de CDRL2 de la SEC ID Nº 13; y iii) una secuencia de aminoácidos de CDRL3 de la SEC ID Nº 19; y b) una región variable de cadena pesada, en la que dicha región variable de cadena pesada comprende; i) una secuencia de aminoácidos de CDRH1 de la SEC ID Nº 25; ii) una secuencia de aminoácidos de CDRH2 de la SEC ID Nº 39; y iii) una secuencia de aminoácidos de CDRH3 de la SEC ID Nº 57. 2.- La composición de la reivindicación 1, en la que dicha molécula de unión a CD20 tiene una afinidad de unión (Kd) por CD20 humana de 1,5 x 10 -10 M o menos. 3.- La composición de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en la que dicha molécula de unión a CD20 tiene una velocidad de disociación (koff) para CD20 humana de 2,5 x 10 -4 s -1 o menos. 4.- La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicha molécula de unión a CD20 tiene una velocidad de asociación (kon) para CD20 humana de 5,0 x 10 5 M -1 s -1 o mayor. 5.- La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº 59. 6.- La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº 61. 7.- La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº 59 y dicha región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº 61. 8.- La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha molécula de unión a CD20 comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de acuerdo con la SEC ID Nº 67. 9.- La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha molécula de unión a CD20 comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de acuerdo con la SEC ID Nº 67 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de acuerdo con la SEC ID Nº 69. 10.- La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha molécula de unión a CD20 comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de acuerdo con la SEC ID Nº 67 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº 61. 11.- La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha molécula de unión a CD20 comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en la que la secuencia de aminoácidos de cada una de las cadenas ligeras es la que se muestra en la SEC ID Nº 67. 12.- Un anticuerpo que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en el que la secuencia de aminoácidos de las cadenas ligeras es la que se muestra en la SEC ID Nº 67 y la secuencia de aminoácidos de cada una de las cadenas pesadas comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº 61. 13.- La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicha región variable de cadena ligera comprende una región flanqueante completamente humana. 14.- La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicha región variable de cadena ligera comprende una región flanqueante de la línea germinal humana. 15.- La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicha región variable de cadena pesada comprende una región flanqueante completamente humana. 31   16.- La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicha región variable de cadena pesada comprende una región flanqueante de la línea germinal humana. 17.- Una composición que comprende una molécula de unión a CD20 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 para su uso como medicamento. 18.- Uso de una molécula de unión a CD20 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, para la preparación de una composición para el tratamiento de linfoma de células B. 19.- El uso de la reivindicación 18, en el que el linfoma de células B se selecciona entre el grupo que consiste en linfoma no Hodgkin y macroglobulinemia de Waldenstrom. 20.- Un sistema de un único vector que codifica una molécula de unión a CD20 de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho vector comprende una secuencia de ácido nucleico de cadena ligera de la SEC ID Nº 68 y una secuencia de ácido nucleico de cadena pesada de la SEC ID Nº 70. 21.- Un sistema de doble vector que codifica una molécula de unión a CD20 de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho sistema de doble vector comprende un primer casete de expresión en un plásmido que comprende una secuencia de ácido nucleico de cadena ligera de la SEC ID Nº 68 y un segundo casete de expresión en un segundo plásmido que comprende una secuencia de ácido nucleico de cadena pesada de la SEC ID Nº 70. 32   33   34     36   37   38   39     41   42   43   44     46   47   48   49