VACUNAS PARA LA PREVENCION Y TRATAMIENTO DE INFECCION POR VIH.

Un polipéptido que comprende Nef o un fragmento o derivado inmunogénico de la misma,

p17 Gag y p24 Gag o fragmentos o derivados inmunogénicos de las mismas, en el que hay al menos un antígeno de VIH o fragmento inmunogénico entre p17 Gag y Gag, comprendiendo adicionalmente el polipéptido RT o un fragmento o derivado inmunogénico de la misma, en el que los fragmentos o derivados inmunogénicos son capaces de aumentar una respuesta inmune frente al antígeno nativo

Vacunas para la prevención y tratamiento de infección por VIH.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a construcciones de polipéptidos de VIH nuevas, a su uso en medicina, a composiciones farmacéuticas que las comprenden y a procedimientos para su fabricación. La invención también se refiere a polinucleótidos que codifican los polipéptidos. En particular, la invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden Nef de VIH-1 y Gag de VIH-1 o fragmentos de los mismos, y a polinucleótidos que los codifican. De forma más particular, la invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden proteínas Nef de VIH-1, Pol de VIH-1 y Gag de VIH-1 o fragmentos de los mismos y a polinucleótidos que los codifican.

El VIH-1 es la causa primaria del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) que está catalogado como uno de los principales problemas de salud en el mundo. Hay una necesidad de una vacuna para la prevención y/o tratamiento de la infección por VIH.

Antecedente de la invención

El VIH-1 es un virus de ARN de la familia de los retrovirales. El genoma del VIH codifica al menos nueve proteínas que se dividen en tres clases: las proteínas estructurales principales Gag, Pol y Env, las proteínas regulatorias Tat y Rev, y las proteínas accesorias Vpu, Vpr, Vif y Nef. El genoma del VIH muestra la organización 5'LTR-gag-pol-env-LTR3' de todos los restrovirus.

La glicoproteína gp120 de envoltura del VIH es la proteína viral que se usa para la adhesión a la célula huésped. Esta adhesión está mediada por la unión de dos moléculas de superficie de las células T de ayuda y macrófagos, conocidos como CD4 y uno de los dos receptores de la quemoquina CCR-5 o CXCR-4. La proteína gp120 se expresa en primer lugar como una molécula precursoras mayor (gp160), que luego se escinde post-translacionalmente para dar gp120 y gp41. La proteína gp120 está retenida sobre la superficie del virón mediante conexión a la molécula gp41, que está insertada en la membrana viral.

La proteína gp120 es la diana principal de los anticuerpos de neutralización, pero desafortunadamente la mayoría de las regiones inmunogénicas de las proteínas (bucle V3) son también las partes más variables de la proteína. Por tanto, se cree que el uso de gp120 (o su precursor gp160) como un antígeno para vacuna para educir anticuerpos de neutralización va a ser de uso limitado para una vacuna ampliamente protectora. La proteína gp120 también contiene epítopos que son reconocidos por linfocitos T citotóxicos (CTL). Estas células efectoras son capaces de eliminar las células infectadas con virus, y por tanto constituyen un segundo mecanismo inmunológico antiviral principal. Al contrario que las regiones diana de anticuerpos de neutralización algunos epítopos de CTL parecen ser conservados relativamente entre diferentes cepas de VIH. Por esta razón gp120 y gp160 pueden ser componentes antigénicos útiles en vacunas que ayudan a educir respuestas inmunes mediadas por células (particularmente CTL).

Proteínas de no envoltura de VIH-1 incluyen, por ejemplo, proteínas estructurales internas tales como los productos de genes gag y pol y otras proteínas no estructurales tales como Rev, Nef, Vif y Tat (Green y col., New England J. Med, 324, 5, 308 y siguientes (1991) y Bryant y col. (Ed. Pizzo), Pediatr. Infect. Dis. J., 11, 5, 390 y siguientes (1992).

La Nef del VIH es una proteína temprana, esto es, es expresada pronto en infección y en ausencia de proteína estructural.

El gen de Nef codifica pronto una proteína del VIH accesoria que ha demostrado poseer varias actividades. Por ejemplo, se sabe que la proteína Nef provoca la baja regulación de CD4, receptor del VIH, y moléculas de clase I MHC de la superficie celular, aunque está en debate la importancia biológica de estas funciones. De forma adicional, Nef interactúa con la ruta de señal de las células T e induce un estado activo, que en cambio puede promover expresión génica más eficiente. Algunos aislados del VIH presentan mutaciones en esta región, lo que hace que no codifiquen proteína funcional y se vean seriamente comprometidos en su replicación y patogénesis in vivo.

El gen de Gag se translada como una poliproteína precursora que se escinde mediante proteasa para dar productos que incluyen la proteína matriz (p17), la cápsida (p24), la nucleocápsida (p9), p6 y dos péptidos espaciales, p2 y p1.

El gen Gag da lugar a la proteína precursora Gag de 55 kilodalton (kD), también denominada p55, que se expresa a partir del ARNm viral no empalmado. Durante la translación el término N de p55 es miristoilado, activando su asociación con el aspecto citoplasmático de las membranas celulares. La poliproteína Gag asociada a la membrana recluta dos copias del ARN genómico viral con otras proteínas virales y celulares que activa la germinación de la partícula viral desde la superficie de una célula infectada. Tras la germinación se esciende la p55 mediante la proteasa codificada viralmente (un producto del gen de pol) durante el proceso de maduración viral en cuatro proteínas más pequeñas designadas MA (matriz [p17]), CA (cápsida [p24]), NC (nucleocápsida [p9]), y p6.

Además de las 3 proteínas Gag principales, todos los precursores de Gag contienen otras regiones distintas, que se escinden y permanecen en el virión como péptidos de varios tamaños. Estas proteínas tienen diferentes papeles, por ejemplo, la proteína p2 tiene un papel propuesto en la regulación de la actividad de la proteasa y contribuye a la cronología correcta del procesamiento proteolítico.

El polipéptido p17 (MA) se deriva del extremo miristoilado, de terminal N de la p55. La mayoría de las moléculas de MA permanecen adheridas a la superficie interna de la bicapa lípida del virión, estabilizando la partícula. Se recluta un subconjunto de MA dentro de las capas más profundas del virión, donde comienza a formar parte del complejo que acompaña al ADN viral al núcleo. Estas moléculas de MA facilitan el transporte nuclear del genoma viral debido a que es reconocida una señal cariofílica en MA por parte de la maquinaria de importación nuclear celular. Este fenómeno permite al VIH infectar las células que no se dividen, una propiedad inusual para un retrovirus.

La proteína p24 (CA) forma el núcleo cónico de las partículas virales. Se ha demostrado que la ciclofilina A interactúa con la región p24 de la p55 llevando a su incorporación a las partículas de VIH. La interacción entre Gag y ciclofilina A es esencial debido a que la disrupción de esta interacción por parte de la ciclosporina A inhibe la replicación viral.

La región NC de Gag es responsable del reconocimiento específico de la denominada señal de empaquetamiento del VIH. La señal de empaquetamiento consiste en cuatro estructuras tallo-bucle localizadas cerca del extremo 5' del ARN viral, y es suficiente para mediar la incorporación de un ARN heterólogo en los viriones de VIH-1. La NC se une a la señal de empaquetamiento a través de interacciones mediadas por dos motivos dedo de cinc. La NC también facilita la transcripción inversa.

La región polipeptídica p6 media las interacciones entre p55 Gag y la proteína accesoria Vpr, llevando a la incorporación de Vpr en viriones de ensamblado. La región p6 también contiene un denominado dominio tardío que se requiere para la liberación eficiente de viriones de germinación desde una célula infectada.

El gen de Pol codifica dos proteínas que contienen las dos actividades necesitadas por el virus en la infección precoz, la RT y la proteína integrasa necesarias para la integración del ADN viral en el ADN de la célula. El producto primario de Pol se escinde mediante la proteasa del virión para dar el péptido RT de terminal amino que contiene necesariamente actividades para la síntesis de ADN (actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN y ADN así como también una función de ARNasa H) y proteína integrasa de terminal carboxi. La RT del VIH es un heterodímero de RT (p66) de longitud completa y un producto de escisión (p51) al que le falta el dominio de ARNasa H de terminal carboxi.

RT es una de las proteínas más altamente conservadas codificada por el genoma retroviral. Dos actividades principales de RT son la ADN Pol y la ribonucleasa H. La actividad de ADN Pol de RT usa ARN y ADN como templados de forma intercambiable y como todas las ADN polimerasas conocidas es incapaz de iniciar la síntesis de ADN de nuevo, pero requiere una molécula pre-existente para servir como...

1. Un polipéptido que comprende Nef o un fragmento o derivado inmunogénico de la misma, p17 Gag y p24 Gag o fragmentos o derivados inmunogénicos de las mismas, en el que hay al menos un antígeno de VIH o fragmento inmunogénico entre p17 Gag y Gag, comprendiendo adicionalmente el polipéptido RT o un fragmento o derivado inmunogénico de la misma, en el que los fragmentos o derivados inmunogénicos son capaces de aumentar una respuesta inmune frente al antígeno nativo.

2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende además Pol o un fragmento o derivado inmunogénico de la misma, en el que el fragmento o derivado inmunogénico es capaz de aumentar toda respuesta inmune frente al antígeno nativo.

3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, en el que RT o fragmento inmunogénico es un fragmento en el que RT está truncada en el término C tal que le falta el dominio ARNasa H de terminal carboxi.

4. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el fragmento de RT es el fragmento p51.

5. El polipéptido de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 2 a 4, en el que RT comprende una mutación en la posición 592 para reemplazar la metionina por otro residuo, por ejemplo, lisina.

6. El polipéptido de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la Nef es Nef de longitud completa.

7. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionado entre uno de los siguientes:

        1.        p24 Gag - RT - Nef - p17 Gag

        2.        p24 Gag - RT* - Nef - p17 Gag

        3.        p24 Gag - p51RT - Nef - p17 Gag

        4.        p24 Gag - p51RT* - Nef - p17 Gag

en los que * representa mutación de metionina₅₉₂ en RT a lisina

8. Un procedimiento para la purificación de un polipéptido de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 1 a 7, tal procedimiento comprende:

        i)        proporcionar una composición que comprende el polipéptido no purificado;

        ii)        someter la composición a al menos dos etapas cromatográficas;

        iii)        de forma opcional carboxiamidación del polipéptido;

        iv)        llevar a cabo una etapa de intercambio en tampón para proporcionar la proteína en un tampón adecuado para una formulación farmacéutica.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que no hay más de dos etapas cromatográficas.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que la carboxiamidación se lleva a cabo entre las dos etapas cromatográficas.

11. Una composición que comprende polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.

12. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la RT o fragmento inmunogénico de la misma es un fragmento en el que RT está truncada en el término C de modo que le falta el dominio ARNasa H de terminal carboxi.

13. La composición de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el fragmento de RT es el fragmento p51.

14. La composición de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 11 a 1, en la que la RT comprende una mutación en la posición 592 tal que la metionina se reemplaza por otro residuo, por ejemplo, lisina.

15. La composición de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 11 a 14, en la que la Nef es Nef de longitud completa.

16. Un polinucleótido o polinucleótidos que codifica un polipéptido o composición de polipéptidos de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 1 a 7 y 11 a 15.

17. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido o polinucleótido o composición de polipéptidos o polinucleótidos de acuerdo con cualquier reivindicación previa o un polipéptido purificado de acuerdo con cualquier reivindicación previa, junto con un vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

18. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 17, en la que el adyuvante es un adyuvante que induce Th1 tal como QS21 o 3D-MPL o una combinación de QS21 y 3D-MPL.

19. Un kit farmacéutico que comprende:

        a)        una composición que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable; y

        b)        una composición que comprende un polinucleótido que codifica una o más de Nef o Gag o un fragmento o derivado inmunogénico de Nef o Gag que contiene un epítopo de Nef o Gag presente en el polipéptido de a), junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, en el que el fragmento o derivado inmunogénico es capaz de aumentar una respuesta inmune frente al antígeno nativo.

20. Un kit farmacéutico que comprende:

        a)        una composición que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, y

        b)        una composición que comprende un polipéptido que comprende uno o más de Nef o Gag o un fragmento o derivado inmunogénico de Nef o Gag que contiene un epítopo de Nef o Gag presente en el polipéptido de a), junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, en el que el fragmento o derivado inmunogénico es capaz de aumentar una respuesta inmune frente al antígeno nativo.