Secuencia de ácido nucleico de chimpancé aislada seleccionada de entre el grupo constituido por:

a)SEC ID nº 1; y

b)una secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia de (a)

Portadores de vacunas de adenovirus de chimpancé.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de vectores recombinantes y más específicamente a la producción y a la utilización de vectores adenovirales de chimpancé de replicación defectuosa recombinantes para producir respuestas inmunitarias en huéspedes mamíferos.

Antecedentes de la invención

Los adenovirus (Ad) comprenden una gran familia de virus de ADN bicatenario que se encuentran en anfibios, aves y mamíferos que presentan una estructura de cápside icosaédrica sin envuelta (Straus, Adenovirus infections in humans. En The Adenoviruses. 451-498, 1984; Hierholzer et al., J. Infect. Dis., 158: 804-813, 1988; Schnurr y Dondero, Intervirology., 36: 79-83, 1993; Jong et al., J Clin Microbiol., 37:3940-3945:1999). A diferencia de los retrovirus, los adenovirus pueden transducir numerosos tipos de células de varias especies de mamíferos, incluyendo tanto células que se dividen como células que no se dividen, sin integrarse en el genoma de la célula huésped.

En términos generales, el ADN adenoviral es normalmente muy estable y permanece episómico (es decir, extracromosómico), a menos que se haya producido transformación o tumorigénesis. Además, los vectores adenovirales pueden propagarse con altos rendimientos en sistemas de producción bien definidos que son fácilmente susceptibles de producción a escala farmacéutica de composiciones de calidad clínica. Estas características y su genética molecular bien caracterizada les hace buenos candidatos para vectores adenovirales recombinantes para su utilización como portadores de vacunas. Normalmente, la producción de vectores adenovirales recombinantes se basa en la utilización de una línea celular de empaquetamiento que puede complementar las funciones de los productos génicos adenovirales que o bien se han delecionado o bien se han modificado mediante ingeniería genética para que no sean funcionales.

En la actualidad, se utilizan ampliamente dos serotipos de adenovirus del subgrupo C humano bien caracterizados (es decir, hAd2 y hAd5) como fuentes de la estructura principal del virus para la mayoría de los vectores adenovirales que se utilizan para terapia génica. También se han sometido a prueba vectores adenovirales humanos de replicación defectuosa como portadores de vacuna para el suministro de una variedad de inmunógenos derivados de una variedad de agentes infecciosos (por ejemplo, virus, parásitos o patógenos bacterianos) y células tumorales, incluyendo antígenos asociados a tumor (TAA). Estudios realizados en animales experimentales (por ejemplo, roedores, perros y primates no humanos) indican que los vectores adenovirales humanos de replicación defectuosa recombinantes que portan transgenes que codifican para inmunógenos derivados de las oncoproteínas E6 y E7 del virus del papiloma humano (VPH-16) (He, Z et al., (2001) Virology, 270:3583-3590, la glicoproteína del virus de la rabia (Xiang, Z. et al (1996) Virology, 219:220-227), la proteína del circumsporozoíto de Plasmodium falciparum (Rodriguez, E. et al. (1997) J. Immunol. 158:1268-1274) así como otros antígenos heterólogos producen respuestas inmunitarias tanto humorales como mediadas por células contra el producto transgénico. En términos generales, los investigadores han notificado el éxito en la utilización de vectores adenovirales humanos como portadores de vacuna en sistemas experimentales no humanos o bien utilizando protocolos de inmunización que utilizan altas dosis de vectores adenovirales recombinantes que se pronostica que producen respuestas inmunitarias; o bien utilizando protocolos de inmunización que emplean la administración secuencial de vectores adenovirales que se derivan de diferentes serotipos pero que portan el mismo producto transgénico como inmunizaciones de refuerzo (Mastrangeli, et al., Human Gene Therapy, 7: 79-87 (1996).

Sin embargo, se pronostica que los portadores de vacuna derivados de serotipos humanos ubicuos, tales como los tipos 2 y 5, se encontrarán con una inmunidad humoral y celular preexistente en la población humana. Por tanto, aunque se han empleado con éxito adenovirus humanos recombinantes de replicación defectuosa como portadores de vacuna en sistemas experimentales que emplean huéspedes roedores, caninos y primates no humanos; se espera que la inmunidad adaptativa e innata humana limite significativamente la utilidad de estos serotipos como portadores de vacuna. Estas expectativas se basan en el hecho de que la infección adenoviral de subgrupo C, que incluye el tipo 2 y el tipo 5, es endémica en la población humana. Como consecuencia, en la mayoría de los seres humanos se produce seroconversión en los primeros cinco años de vida como resultado de una infección natural. Por tanto, los vectores derivados de virus que infectan de manera natural y se replican en seres humanos pueden no ser candidatos óptimos para su utilización como portadores de vacuna.

Otro problema asociado con la utilización de vectores derivados de adenovirus humanos es el riesgo de que el procedimiento de producción utilizado para propagar los virus recombinantes dé lugar a reservas de vectores que se contaminan con adenovirus de replicación competente (RCA). Esto está provocado por la recombinación homóloga entre secuencias solapantes del vector recombinante y los genes adenovirales que están presentes en las líneas celulares auxiliares de complementación de E1 tales como células 293 humanas (Graham, F.L. et al, (1977) J. Gen. Virol. 36:59-72.). La presencia de RCA en reservas de vectores preparados para su utilización en ensayos clínicos constituye un riesgo de seguridad porque puede promover la movilización y propagación del virus de replicación defectuosa. La propagación del virus defectuoso puede agravar la respuesta inmunitaria del huésped y provocar otras consecuencias inmunopatológicas adversas (Fallux, F. J., et al. Human Gene Therapy 9: 1909-1917 (1998). Por consiguiente, la Food and Drug Administration (FDA) y otros organismos reguladores han promulgado directrices que establecen límites sobre los niveles de RCA que pueden estar presentes en preparaciones de vectores destinadas a utilización clínica. El intento de imponer límites de RCA es para garantizar una exposición limitada de los pacientes a adenovirus en replicación en composiciones que se utilizan en ensayos clínicos.

Por tanto, sigue habiendo una necesidad del desarrollo de portadores de vacuna adenovirales que sean adecuados para su utilización en huéspedes mamíferos que sean: fáciles de manipular, susceptibles de producción a escala farmacéutica y almacenamiento a largo plazo, que puedan replicarse a alto nivel en líneas celulares de complementación humanas, sumamente inmunógenos, que carezcan de epítopos de células B neutralizantes que reaccionen de manera cruzada con los serotipos comunes de adenovirus humanos, que cumplan con las normas de seguridad de RCA promulgadas por agencias reguladoras y que sean susceptibles de utilización en protocolos de sensibilización/refuerzo que sean adecuados para su utilización en seres humanos.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a vectores de adenovirus de replicación defectuosa derivados de adenovirus ChAd3 de chimpancé (SEC ID nº 1) y a procedimientos para generar dichos vectores adenovirales de chimpancé en líneas celulares que expresan E1 humano. La invención también proporciona procedimientos para generar reservas de vectores de calidad clínica adecuados para su utilización en seres humanos y medios para utilizar los vectores dados a conocer como portadores de vacuna para producir respuestas inmunitarias protectoras y/o terapéuticas. La invención proporciona además procedimientos para utilizar los adenovirus recombinantes de la invención para preparar composiciones de vacunas diseñadas para suministrar, y dirigir la expresión de, transgenes que codifican para inmunógenos. En una forma de realización, la invención contempla la utilización de los vectores dados a conocer como portadores de vacuna para la administración de vacunas que comprenden transgenes que codifican para inmunógenos derivados de un agente infeccioso. En una segunda forma de realización, la invención contempla la utilización de los vectores dados a conocer para preparar y administrar vacunas contra el cáncer. En una forma de realización particular, la invención contempla la preparación y administración de una vacuna contra el cáncer que comprende un transgén que codifica para un TAA.

Se dan a conocer en la presente memoria las secuencias genómicas...

1. Secuencia de ácido nucleico de chimpancé aislada seleccionada de entre el grupo constituido por:

2. Vector adenoviral de chimpancé (ChAd) de replicación defectuosa que comprende:

la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID nº 1, modificada porque por lo menos un gen seleccionado de entre el grupo constituido por E1, E2 y E4 adenoviral está funcionalmente delecionado; y

un transgén que codifica para por lo menos un inmunógeno funcionalmente unido a secuencias reguladoras que dirigen la expresión de dicho transgén en células de mamífero.

3. Vector de ChAd de replicación defectuosa según la reivindicación 2, en el que la secuencia de nucleótidos que corresponde a por lo menos un gen seleccionado de entre el grupo constituido por E1, E2 y E4 adenoviral se ha delecionado.

4. Vector de ChAd de replicación defectuosa según la reivindicación 2, caracterizado porque comprende la deleción funcional de E1 y opcionalmente de E3.

5. Vector de ChAd de replicación defectuosa según la reivindicación 2 ó 4, que comprende una deleción/alteración en la secuencia de nucleótidos de E1 en la región desde el pb 460 hasta el pb 3542 de SEC ID nº 1.

6. Vector de ChAd según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que el vector comprende un transgén seleccionado de entre el grupo constituido por: VIH, VHB, VHC, VPH, VHS1, VHS2, SARS CoV, Plasmodium malariae, virus Ébola, virus del oeste del Nilo, virus del Dengue, gripe A, gripe B y Mycobacterium tuberculosis.

7. Vector de ChAd según la reivindicación 5, comprendiendo el vector una deleción/alteración en la secuencia de nucleótidos de E1 en la región desde el pb 460 hasta el pb 3542 de SEC ID nº 1 y comprendiendo el vector además un transgén que codifica para por lo menos un antígeno asociado a tumor (TAA).

8. Vector de ChAd según la reivindicación 7, en el que el por lo menos un TAA se selecciona de entre el grupo constituido por: HER2 NEU, CEA, EPCAM, PSA, PSMA, TELOMERASA, GP100, MELAN-A/MART-1, MUC-1, NY-ESO-1, SURVIVINA, ESTROMELISINA 3, TIROSINASA, MAGE3, CML68, CML66, OY-TES-1, SSX-2, SART-1, SART-2, SART-3, NY-CO- 58, NY-BR-62, HKLP2, 5T4 y VEGFR2.

9. Célula huésped que comprende un vector de ChAd de replicación defectuosa según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en la que dicha célula huésped expresa una o varias regiones adenovirales seleccionadas de entre el grupo constituido por E1a, E1b, E2a, E2b, E4 orf 1, 2, 3, 4, 5, 6, 6/7, pIX, IVa2, regiones L1, L2, L3, L4, L5.

10. Procedimiento de producción de un vector adenoviral de chimpancé de replicación defectuosa que comprende introducir un vector adenoviral según la reivindicación 5 en una célula humana que expresa E-1 adenoviral, y recoger los adenovirus resultantes.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la célula humana es una célula 293 o una célula PER.C6^TM.

12. Composición de vacuna que comprende un vector de ChAd de replicación defectuosa según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8.

13. Célula humana que expresa E1 adenoviral que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID nº 1, en la que la secuencia de nucleótidos comprende una deleción/alteración en la secuencia de nucleótidos de E1 en la región desde el pb 460 hasta el pb 3542 de SEC ID nº 1.

14. Vector de ChAd según la reivindicación 5 para su utilización en un procedimiento de refuerzo de una respuesta inmunitaria específica de antígeno en un mamífero que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad suficiente de dicho vector de ChAd, en el que la administración de dicho vector de ChAd produce una respuesta reforzada.

15. Vector de ChAd según la reivindicación 14, que comprende una deleción completa de sus genes E1 y en el que el vector comprende además opcionalmente una deleción de sus genes E3.

16. Vector de ChAd según la reivindicación 14 ó 15, en el que la respuesta inmunitaria reforzada es específica para un antígeno derivado de un agente infeccioso seleccionado de entre el grupo constituido por: VIH, VHB, VHC, VPH, VHS1, VHS2, SARS CoV, Plasmodium malariae, virus Ébola, virus del oeste del Nilo, virus del Dengue, Gripe A, Gripe B y Mycobacterium tuberculosis.

17. Vector de ChAd según la reivindicación 14 ó 15, en el que la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria reforzada que es específica para un TAA.

18. Vector de ChAd según la reivindicación 14, 15 ó 17, en el que la respuesta inmunitaria reforzada comprende la producción de células T CD8+ específicas de antígeno.

19. Vector de ChAd según la reivindicación 5 para su utilización en un procedimiento de producción de una respuesta inmunitaria en un mamífero sin tratamiento previo que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad suficiente de dicho vector de ChAd, en el que la administración del vector de ChAd produce una respuesta inmunitaria primaria.

20. Vector de ChAd según la reivindicación 19, en el que la respuesta inmunitaria primaria es específica para un antígeno derivado de un agente infeccioso seleccionado de entre VIH, VHC, VPH, VHS1, VHS2, SARS CoV, Plasmodium malariae, virus Ébola, virus del oeste del Nilo, virus del Dengue, Gripe A, Gripe B, Mycobacterium tuberculosis.

21. Vector de ChAd según la reivindicación 19, en el que la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria primaria que es específica para un TAA contra el que el mamífero es tolerante.

22. Vector de ChAd según la reivindicación 5 para su utilización en un procedimiento de inducción de una respuesta inmunitaria contra un antígeno derivado de un agente infeccioso seleccionado de entre el grupo constituido por: VIH, VHC, VPH, VHS1, VHS2, SARS, Plasmodium malariae, virus Ébola, virus del oeste del Nilo, virus del Dengue, Gripe A, Gripe B y Mycobacterium tuberculosis que comprende las etapas siguientes:

en el que la administración de la composición de refuerzo produce una respuesta inmunitaria que presenta el efecto de conferir inmunidad protectora.

23. Vector de ChAd según la reivindicación 5 para su utilización en un procedimiento de rotura de la tolerancia del huésped a un autoantígeno que comprende:

en el que la administración de la composición de refuerzo produce una respuesta inmunitaria que presenta el efecto de romper la tolerancia del huésped al autoantígeno.

24. Vector de ChAd según la reivindicación 23, que comprende ADN que codifica para un autoantígeno seleccionado de entre el grupo constituido por: HER2 NEU, CEA, HEPCAM, PSA, PSMA, TELOMERASA, GP100, MELAN-A/MART-1, MUC-1, NY-ESO-1, SURVIVINA, ESTROMELISINA 3, TIROSINASA, MAGE3, CML68, CML66, OY-TES-1, SSX-2, SART-1, SART-2, SART-3, NY-CO-58, NY-BR-62, HKLP2, 5T4 y VEGFR2.

25. Vector de ChAd según la reivindicación 22 ó 23, en el que la primera composición de vacuna comprende ADN de plásmido que se administra por vía intramuscular en combinación con estimulación eléctrica.

26. Vector de ChAd según la reivindicación 22 ó 23, en el que la respuesta inmunitaria comprende la producción de células T CD8+ específicas de antígeno.