LINEA CELULAR DE SUSPENSION UNICELULAR DE SPODOPTERA FRUGIPERDA EN MEDIO LIBRE DE SUERO, PROCEDIMIENTOS DE PRODUCCION Y DE UTILIZACION DE LA MISMA.
Línea celular de insecto Sf900+ (ATCC CRL-12579)
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US99/22862.
Solicitante: PROTEIN SCIENCES CORPORATION.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 1000 RESEARCH PARKWAY,MERIDEN, CT 06450-7159.
Inventor/es: DEBARTOLOMEIS, JAMES, VOZNESENSKY, ANDREI, I., SMITH,GALE,E, FOELLMER,HARALD,G, KNELL,JOHN.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 21 de Julio de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K14/16B
- C07K14/285 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Pasteurellaceae (F), p. ej. Haemophilus influenza.
- C07K14/505 C07K 14/00 […] › Eritropoyetina (EPO).
- C07K14/78 C07K 14/00 […] › Péptidos del tejido conectivo, p. ej. colágeno, elastina, laminina, fibronectina, vitronectina, globulina insoluble en frío (CIG).
- C12N5/06A
Clasificación PCT:
- C12N5/00 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00).
Clasificación antigua:
- C12N5/00 C12N […] › Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00).
Fragmento de la descripción:
Línea celular de suspensión unicelular de Spodeptera frugiperda en medio libre de suero, procedimientos de producción y de utilización de la misma.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una línea celular continua de insecto que crece como una suspensión unicelular en un medio de cultivo libre de suero. Más específicamente, las células se autopropagan; crecen en suspensión como células individuales; se dividen en medio libre de suero, son estables y se propagan continuamente durante, por lo menos, 6 meses y 50 pases; están libres de agentes adventicios detectables incluyendo el micoplasma, del esferoplasma y virus que comprenden los retrovirus; soportan la multiplicación de los baculovirus y producen títulos elevados de virus; y producen productos génicos foráneos para su utilización en aplicaciones sanitarias humanas y animales.
Antecedentes de la invención
Las células de insecto que soportan la multiplicación de los baculovirus fueron inicialmente de interés para el estudio de la biología básica de los virus de los insectos y para la aplicación agronómica de los baculovirus para el control microbiano de plagas. Hink [Nature, 226:466-467, 1970] describió las primeras células continuas de insecto (Lepidóptero) que demostraron soportar la multiplicación de los baculovirus. Faulkner y Henderson [Virology, 50:920-924, 1972] demostraron que los baculovirus podían propagarse continuamente en una línea celular estable de insecto. Más recientemente, con el desarrollo de los sistemas de vectores de expresión de baculovirus, ha adquirido importancia la necesidad de células de insecto que se pudiesen utilizar para la producción comercial de productos sanitarios y diagnósticos humanos y animales.
Los sistemas comúnmente utilizados para la producción de productos de ADN recombinante son bacterias, levaduras, células de mamífero e insecto y animales transgénicos. El procedimiento general consiste en introducir genes foráneos en las células u organismos generando una línea celular transformada u organismo transgénico, que son únicos para cada producto génico. Sin embargo, en el sistema de expresión de baculovirus, los genes foráneos se clonan en vectores baculovíricos individuales y se puede utilizar una única línea celular de insecto, susceptible a la infección por baculovirus, para la producción de una cantidad ilimitada de productos génicos foráneos.
La línea celular ideal de insecto para la utilización con vectores de expresión de baculovirus se multiplicaría continuamente en suspensión como células individuales lo que las haría ideales para la utilización a gran escala en biorreactores farmacéuticos. Las células de insecto también deberían crecer a gran densidad con un elevado grado de viabilidad en un medio barato libre de suero y soportarían la multiplicación de los baculovirus con un título elevado. La línea celular de insecto ideal cuando fuese infectada con un baculovirus recombinante genéticamente modificado produciría niveles elevados de los productos génicos de modo consistente durante muchos pases. La célula de insecto ideal para la producción de productos farmacéuticos a partir de vectores de expresión de baculovirus debería también cumplir todos los requerimientos reguladores de la seguridad e identidad y sería fácil de expandir a biorreactores a gran escala para la producción de productos farmacéuticos. Finalmente, debido al elevado coste del suero y el potencial de contaminación con agentes adventicios tales como la encefalopatía bovina espongiforme, una enfermedad degenerativa crónica que afecta el sistema nervioso central de las vacas (enfermedad de las vacas locas), la línea celular de insecto ideal se almacenaría y cultivaría en medio libre de suero. Hasta la fecha, no se ha descrito tal línea celular de insecto con estas propiedades ideales. El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una línea celular de insecto, preferentemente una línea celular con una cualquiera o todas estas propiedades ideales.
Los baculovirus se utilizan ampliamente para la expresión de genes foráneos en células de insecto [ver, por ejemplo, Smith et al., patente US nº 4.745.051 (baculovirus recombinante) y 4.879.236; Summers and Smith, "A manual of methods for baculovirus vector and insect cell culture procedures" Mayo 1987, Texas A&M University; O'Reilly et al., "Baculovirus expression vectors. A laboratory manual", 1994, Oxford University Press; y referencias comprendidas].
En particular, los baculovirus tales como el virus de la polihedrosis nuclear de la Autographa californica (AcNPV) se multiplican en líneas celulares estables de insecto lepidóptero que comprenden las derivadas del tejido ovárico de la "oruga militar" otoñal (Spodoptera frugiperda) y el saltamontes de la col (Tichoplusia ni) y el tejido del intestino medio de T. ni. Las líneas celulares más comúnmente utilizadas para mantener la multiplicación de AcNPV y la producción de productos recombinantes son las células S. frugiperda IPLB-SF-21 [Vaughn, et al., In Vitro 13:213-217, 1977] y S. frugiperda Sf-9 [Summers and Smith, supra, las células T.niTN-368 [Hink, lbid. 1970] y las células T.ni BTI-TN-5-B1-4 [Granados, patente US nº 5.300.435 y nº 5.298.418]. Las células SF-9 (ATCC CRL-1711) y BTI-TN-5-B1-4 (ATCC CRL 10859) se clonaron en medio que comprende 10% u 8% de Suero Bovino Fetal, respectivamente. Estas y otras células de insecto se pueden adaptar a medio comercial libre de suero, tal como Sf-900 II SFM (Life Technologies, Grand Island, NY 14072), utilizando procedimientos conocidos en la técnica. La adaptación repetitiva de las células para su utilización en la producción de productos farmacéuticos no es deseable debido a que ocupa tiempo, puede producir células con propiedades diferentes en cada adaptación y el cultivo celular adaptado podría comprender niveles oscilantes de suero residual.
Además, las células BTI-TN-5-B1-4 se agregan considerablemente en suspensión en el medio libre de suero, reduciendo su efectividad como células huésped para la producción de productos génicos foráneos con vectores baculovíricos. La utilización de poli aniones sulfatados no-carboxilados puede ayudar a superar estos problemas [Shuler y Dee, patente US nº 5.728.580, marzo, 17, 1998]. Sin embargo, los polianiones sulfatados pueden bloquear la infección de las células con los baculovirus, complicando así su utilización en la producción de productos génicos recombinantes.
La insulina es una hormona peptídica anabólica importante en la regulación del metabolismo de la glucosa. Las células de mamífero e insecto siguen patrones semejantes para el metabolismo de la glucosa desde la glucosa al ácido pirúvico; por consiguiente, no es sorprendente que se produzcan péptidos semejantes a la insulina en los insectos. La hormona protoracicotrópica (PTTH) de los insectos activa las glándulas protorácicas para producir ecdisona, la hormona de la muda. La PTTH bombexina del gusano de seda Bombix mori tiene una homología del 40% con la insulina humana. La bombexina se une a receptores específicos e induce cambios morfológicos en una línea celular de B. mori, específicamente aumenta el tamaño celular 1 a 2 semanas después de la exposición a bajas concentraciones de bombexina [Tanaka, M., et al., Regul. Pept. 57(3):311-318, 1995]. Las células Sf9 de S. frugiperda tienen receptores para la bombexina, la hormona peptídica semejante a la insulina y la bombexina de B. mori se une con una elevada afinidad a los receptores de las células de S. frugiperda con una constante de disociación de aproximadamente 0,26 nM [Fillbright et al., Eur. J. Biochem. 245(3):774-780, 1997]. Aunque la insulina se utiliza comúnmente en los medios de cultivo para las células de mamífero, no se ha descrito para ser utilizada en medio para células de insecto. Goodwin y Adams [Ed. Kurstak, Maramorosch, Dubendorfer, Invertebrate Systems In Vitro, Elsevier/North-Holland Biomedical Press, 443-509, 1980] describieron que 35 unidades/litro de insulina no afectaron el crecimiento de las células del insecto Lymantria dispar. En la presente invención se utilizó medio con insulina libre de suero para la generación de una nueva línea celular de S. frugiperda.
Se hace también referencia a las patentes US nº 4.072.565; nº 5.135.866; nº 5.532.156 y nº 5.024.947. Inslow et al., patente US nº 5.024.947 se refiere a un medio libre de suero para el crecimiento de células de insecto...
Reivindicaciones:
1. Línea celular de insecto Sf900+ (ATCC CRL-12579).
2. Procedimiento para obtener una línea celular de insecto que comprende someter lepidópteros, noctuidos, Spodoptera frugiperda Sf-9 (ATCC CRL-1711) a múltiples ciclos de dilución limitante y selección en un medio de insectos libre de suero suplementado con insulina humana añadida, en el que la línea celular de insecto obtenida es genética y morfológicamente diferente de las células parentales Sf-9.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, que comprende:
4. Procedimiento destinado a la producción de; eritropoyetina glicosilada recombinante sustancialmente pura, producida mediante un sistema de expresión de baculovirus en células de insecto cultivadas, en el que las células de insecto cultivadas son de la línea celular reivindicada en la reivindicación 1, en el que dicha eritropoyetina presenta homogeneidad relativa o está purificada al 95% o superior y dicha eritropoyetina estimula la eritropoyesis y presenta una actividad de por lo menos 200.000 U/mg.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la eritropoyetina presenta una actividad de aproximadamente 500.000 U/mg.
6. Procedimiento para la producción de neuraminidasa glicosilada recombinante sustancialmente pura, producida mediante un sistema de expresión de baculovirus en células de insecto cultivadas, en el que las células de insecto cultivadas son de la línea celular reivindicada en la reivindicación 1, en el que dicha neuraminidasa se purifica al 95% o superior y dicha neuraminidasa presenta actividad de sialidasa.
7. Procedimiento para la producción de CD4 glicosilado recombinante sustancialmente puro, producido mediante un sistema de expresión de baculovirus en células de insecto cultivadas, en el que dichas células de insecto cultivadas son de la línea celular reivindicada en la reivindicación 1 y en el que dicho CD4 se purifica al 95% o superior y dicho CD4 es secretado y se une con elevada afinidad a gp120 de HIV-1.
8. Procedimiento para la producción de trombospondina recombinante sustancialmente pura, producida mediante un sistema de expresión de baculovirus en células de insecto cultivadas, en el que las células de insecto cultivadas son de la línea celular reivindicada en la reivindicación 1 y en el que dicha trombospondina se purifica al 95% o superior y dicha trombospondina es antiangiogénica.
9. Procedimiento para la producción de CEA glicosilado recombinante sustancialmente puro, producido mediante un sistema de expresión de baculovirus en células de insecto cultivadas, en el que las células de insecto cultivadas son de la línea celular reivindicada en la reivindicación 1 y en el que dicho CEA se purifica al 95% o superior y dicho CEA induce una respuesta inmunológica anti-CEA en humanos.
10. Procedimiento para la producción de eritropoyetina recombinante glicosilada sustancialmente pura, producida mediante un sistema de expresión de baculovirus en células de insecto cultivadas, en el que dicha eritropoyetina presenta una homogeneidad relativa o está purificada al 95% o superior y dicha eritropoyetina estimula la eritropoyesis y presenta una actividad de por lo menos 200.000 U/mg o de aproximadamente 500.000 U/mg; o
una neuraminidasa glicosilada recombinante sustancialmente pura, producida mediante un sistema de expresión de baculovirus en células de insecto cultivadas, en el que dicha neuraminidasa está purificada al 95% o superior y dicha neuraminidasa presenta actividad de sialidasa;
un CD4 glicosilado recombinante sustancialmente puro, producido mediante un sistema de expresión de baculovirus en células de insecto cultivadas, en el que dicho CD4 se purifica al 95% o superior y dicho CD4 es secretado y se une con elevada afinidad a gp120 de HIV-1; o
una trombospondina glicosilada recombinante sustancialmente pura, producida mediante un sistema de expresión de baculovirus en células de insecto cultivadas, en el que dicha trombospondina se purifica 95% o superior y dicha trombospondina es antiangiogénica; o
un CEA glicosilado recombinante sustancialmente puro, producido mediante un sistema de expresión de baculovirus en células de insecto cultivadas, en el que dicho CEA se purifica al 95% o superior y dicho CEA induce una respuesta inmunológica anti-CEA en los seres humanos; o
una hemaglutinina de influenza madura glicosilada recombinante sustancialmente pura, producida por un sistema de expresión de baculovirus en células de insecto cultivadas, en el que dicha hemaglutinina se purifica al 95% o superior y dicha proteína es inmunogénica e induce una respuesta inmunológica protectora cuando se utiliza como vacuna;
en el que las células de insecto cultivadas son de la línea celular de insecto reivindicada en la reivindicación 1.
11. Procedimiento para la expresión de ADN codificante exógeno de un sistema de expresión de baculovirus que comprende un baculovirus recombinante que comprende el ADN codificante exógeno, que comprende infectar células de insecto de una línea celular de insecto reivindicada en la reivindicación 1 con el baculovirus recombinante.
12. Procedimiento para la obtención de una línea celular de insecto que comprende someter las células Sf-9 de Lepidóptero, Noctuidae, Spodoptera frugiperda designadas ATCC CRL-1771 a dilución y selección en un medio de insecto libre de suero suplementado con insulina humana añadida, en el que la línea celular de insecto que se obtiene es genética y morfológicamente diferente a las células Sf-9 parentales.
13. Procedimiento según la reivindicación 12 que comprende:
14. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el ADN codificante exógeno codifica la eritropoyetina.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que la eritropoyetina presenta una actividad de por lo menos aproximadamente 200.000 U/mg.
16. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el ADN codificante exógeno codifica la neuraminidasa.
17. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el ADN codificante exógeno codifica el CD4.
18. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el ADN codificante exógeno codifica la trombospondina.
19. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el ADN codificante exógeno codifica el CEA.
20. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que la eritropoyetina presenta una actividad de aproximadamente 500.000 U/mg.
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