RECEPTOR RTD.

Polipéptido RTD aislado que tiene al menos un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia nativa del polipéptido RTD que comprende los residuos de los aminoácidos 1 a 386 de la Fig.

1A (SEC DE ID Nº: 1), en el que dicho polipéptido RTD aislado inhibe la apoptosis inducida por el ligando Apo-2 en una célula de mamífero o se une al ligando Apo-2

Receptor RTD.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a la identificación, aislamiento, y producción recombinante de polipéptidos novedosos, designados en el presente documento como "RTD" y a anticuerpos anti-RTD.

Antecedentes de la invención

Apoptosis o "muerte celular programada"

Se cree que el control del número de células en los mamíferos se va a determinar, en parte, por un equilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular. Una forma de muerte celular, denominada algunas veces como muerte celular necrótica, se caracteriza normalmente como una forma patológica de muerte celular que es el resultado de algún trauma o lesión celular. Por el contrario, existe otra forma "fisiológica" de muerte celular que procede de una manera ordenada o controlada. Esta forma ordenada o controlada de muerte celular se denomina a menudo como "apoptosis" (véanse, por ejemplo, Barr y col., Bio/Technology, 12:487-493 (1994); Steller y col., Science, 267:1443-1449 (1995)]. La muerte celular apoptótica se produce naturalmente en muchos procesos fisiológicos, que incluyen el desarrollo embriónico y la selección clonal en el sistema inmune [Itoh y col:, Cell, 66:233-243 (199))]. La disminución en los niveles de muerte celular apoptótica se ha asociado con una variedad de dolencias patológicas, que incluyen cáncer, lupus, e infección por el virus del herpes [Thompson, Science, 267:1456-1462 (1995)]. El aumento en los niveles de muerte celular apoptótica puede estar asociado con otra variedad de dolencias patológicas, que incluyen SIDA, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, retinitis pigmentaria, degeneración cerebelosa, anemia aplásica, infarto de miocardio, apoplejía, lesión por revascularización, y enfermedad hepática inducida por toxina [véase, Thompson, más arriba].

La muerte celular apoptótica está acompañada normalmente por uno o más cambios morfológicos y bioquímicos característicos en las células, tales como la condensación del citoplasma, la pérdida de las microvellosidades de la membrana plasmática, la segmentación del núcleo, la degradación del ADN cromosómico o la pérdida de la función mitocondrial. Se cree que una variedad de señales extrínsecas e intrínsecas desencadenan o inducen dichos cambios celulares morfológicos y bioquímicos [Raff, Nature, 356:397-400 (1992); Steller, supra; Sachs y col., Blood, 82:15 (1993)]. Éstas se pueden estimular, por ejemplo, mediante estímulos hormonales, tales como las hormonas glucocorticoides en timocitos inmaduros, así como la retirada de algunos factores de crecimiento [Watanabe-Fukunaga y col., Nature, 356:314:317 (1992)]. Se ha informado también de que algunos oncogenes identificados tales como myc, rel, y EIA, y supresores tumorales, del tipo p53, tienen un papel en la inducción de la apoptosis. Se ha observado igualmente que algunos fármacos de quimioterapia y algunas formas de radiación tienen actividad inductora de la apoptosis [Thompson, más arriba]

Familia de citocinas TNF

Se han identificado diversas moléculas, tales como el factor a de necrosis tumoral ("TNF-a"), factor ß de necrosis tumoral ("TNF-ß" o "linfotoxina"), ligando CD30, ligando CD27, ligando CD40, ligando OX-40, ligando 4-1 BB, ligando Apo-1 (denominado también como ligando FAS o ligando CD95), y el ligando Apo-2 (denominado también como TRAIL) como miembros de la familia de citocinas del factor de necrosis tumoral ("TNF") [Véanse, por ejemplo, Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Wiley y col., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti y col., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996)]. Entre estas moléculas, se ha informado de que TNF-a, TNF-ß, ligando CD30, ligando 1-IBB, ligando Apo-I, y ligando Apo-2 (TRAIL) están implicados en la muerte celular apoptótica. Se ha informado de que TNF-a y TNF-ß inducen la muerte apoptótica en células tumorales susceptibles [Schmid y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry y col., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987)]. Zheng y col., han informado de que TNF-a está implicado en la apoptosis tras la estimulación de células T CD8 positivas [Zheng y col., Nature. 377:348-351 (1995)]. Otros investigadores han informado de que el ligando CD30 puede estar implicado en la deleción de células T autorreactivas en el timo (Amakawa y col., Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, Resumen Nº. 10, (1995)].

Las mutaciones en los genes del ligando o el receptor Fas/Apo-I de ratón (denominados Ipr y gld, respectivamente) se han asociado con algunos trastornos autoinmunes, los que indica que el ligando Apo-I puede jugar un papel en la regulación de la deleción clonal de linfocitos autorreactivos en la periferia [Krammer y col., Curr. Op. Immunol., 6:279-289 (1994); Nagata y col., Science, 267:1449-1456 (1995)]. Se ha informado también de que el ligando Apo-I induce la apoptosis tras estimulación en linfocitos T CD4 positivos y en linfocitos B, y puede estar implicado en la eliminación de los linfocitos activados cuando su función ya no es necesaria [Krammer y col., más arriba; Nagata y col., más arriba]. Se ha informado de anticuerpos monoclonales agonistas de ratón que se unen específicamente al receptor Apo-1 que presentan una actividad de muerte celular que es comparable o similar a la de TNF-a [Yonehara y col., L Exp. Med., 169:1747-1756 (1989)].

Familia de receptores TNF

Se cree que la inducción de diversas respuestas celulares mediadas por dicha familia TNF de citocinas se va a iniciar mediante su unión a receptores celulares específicos. Se han identificado dos receptores TNF distintos de aproximadamente 55 kDa (TNFR1) y 75 kDa (TNFR2) [Hohman y col., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990); documento EP 417.563, publicado el 20 de marzo de 1991] y se han aislado y caracterizado los ADNc humano y de ratón que corresponden a ambos tipos de receptores [Loetscher y col., Cell, 61:351 (1990); Schall y col., Cell, 61:361 (1990); Smith y col., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin y col., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991)]. Se han asociado extensos polimorfismos con ambos genes del receptor TNF [véase, por ejemplo, Takao y col., Immunogenetics, 37:199-203 (1993)]. Ambos TNFR comparten la estructura típica de los receptores superficiales celulares incluyendo las regiones extracelular, transmembrana e intracelular. Las porciones extracelulares de ambos receptores se encuentran naturalmente también como proteínas de unión a TNF solubles [Nophar, Y. y col., EMBO J., 9:3269 (1990); y Kohno, T. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 87:8331 (1990)]. Más recientemente, Hale y col. [J. Cell. Biochem. Suplemento 15F, 1991, p. 113 (P424)]. informaron de la clonación de receptores TNF solubles recombinantes.

La porción extracelular de los TNFR de tipo I y tipo 2 (TNFR1 y TNFR2) contiene un modelo repetitivo de secuencia de aminoácidos de las cuatro regiones ricas en cisteína (CRD) designadas I a 4, comenzando desde el término NH₂. Cada CRD tiene aproximadamente 40 aminoácidos de longitud y contiene de 4 a 6 restos de cisteína en posiciones que están bien conservadas [Schall y col., más arriba; Loetscher y col., más arriba; Smith y col., más arriba; Nophar y col., más arriba; Kohno y col., más arriba]. En TNFR1, los límites aproximados de las cuatro CRD son como sigue: CRD1- aminoácidos 14 a aproximadamente 53; CRD2-aminoácidos desde aproximadamente 54 a aproximadamente 97; CRD3-aminoácidos desde aproximadamente 98 a aproximadamente 138; CRD4-aminoácidos desde aproximadamente 139 a aproximadamente 167. En TNFR2, CRD1 incluye los aminoácidos 17 a aproximadamente 54; CRD2-aminoácidos desde aproximadamente 55 a aproximadamente 97; CRD3-aminoácidos desde aproximadamente 98 a aproximadamente 140; y CRD4-aminoácidos desde aproximadamente 141 a aproximadamente 179 [Banner y col., Cell, 73:431-435 (1993)]. Banner y col., más arriba, describen también el papel potencial de las CRD en la unión del ligando.

Existe un modelo repetitivo similar de las CRD en otras diversas proteínas superficiales celulares, que incluyen el receptor del factor de crecimiento nervioso p75 (NGFR) [Johnson y col., Cell, 47:545 (1986); Radeke y col., Nature, 325:593 (1987)], el antígeno CD40 de las células B [Stamenkovic y col., EMBO J., 8:1403 (1989)], el antígeno OX40 de las células T (Mallet y col., EMBO J., 9:1063 (1990)] y el antígeno FAS [Yonehara y col., más arriba e Itoh...

1. Polipéptido RTD aislado que tiene al menos un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia nativa del polipéptido RTD que comprende los residuos de los aminoácidos 1 a 386 de la Fig. 1A (SEC DE ID Nº: 1), en el que dicho polipéptido RTD aislado inhibe la apoptosis inducida por el ligando Apo-2 en una célula de mamífero o se une al ligando Apo-2.

2. Polipéptido RTD según la reivindicación 1 que comprende los residuos de los aminoácidos 1 a 386 de la Fig. 1A (SEC DE ID Nº: 1).

3. Polipéptido RTD según la reivindicación 1 que comprende los residuos de los aminoácidos 56 a 386 de la Fig. 1A (SEC DE ID Nº: 1).

4. Secuencia del dominio extracelular aislada del polipéptido RTD que comprende (a) los residuos de los aminoácidos 1 a 212 de la Fig. 1A (SEC DE ID Nº: 1); o (b) un fragmento de las secuencias de (a) que retiene la capacidad de unirse al ligando Apo-2.

5. Secuencia del dominio extracelular según la reivindicación 4 que comprende los residuos de los aminoácidos 56 a 212 de la Fig. 1A (SEC DE ID Nº: 1).

6. Molécula quimérica que comprende un polipéptido RTD o la secuencia del dominio extracelular del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, fusionada con una secuencia de aminoácidos heteróloga.

7. Molécula quimérica según la reivindicación 6 en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una secuencia del epítopo etiqueta.

8. Molécula quimérica según la reivindicación 6 en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una secuencia de inmunoglobulina.

9. Molécula quimérica según la reivindicación 6 en la que dicha secuencia de inmunoglobulina es una IgG.

10. Anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido RTD o la secuencia del dominio extracelular del mismo según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

11. Anticuerpo según la reivindicación 10 en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

12. Anticuerpo según la reivindicación 10 que es un anticuerpo quimérico.

13. Anticuerpo según la reivindicación 10 que es un anticuerpo humanizado.

14. Anticuerpo según la reivindicación 10 que es un anticuerpo humano.

15. Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido RTD según la reivindicación 1 o la secuencia del dominio extracelular según la reivindicación 4 o la reivindicación 5.

16. Ácido nucleico según la reivindicación 15 en el que dicha secuencia de nucleótidos codifica la secuencia nativa del polipéptido RTD que comprende los residuos de los aminoácidos 1 a 386 de la Fig. 1A (SEC DE ID Nº: 1).

17. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 15 o la reivindicación 16.

18. Vector según la reivindicación 17 unido de manera operativa a las secuencias control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.

19. Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 17.

20. Célula huésped según la reivindicación 19 que es una célula de mamífero.

21. Célula huésped según la reivindicación 19 que es una célula de levadura.

22. Célula huésped según la reivindicación 19 que es E. coli.

23. Procedimiento para usar una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 15 o la reivindicación 16 para realizar la producción del polipéptido RTD que comprende cultivar la célula huésped según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22.

24. Composición que comprende el polipéptido RTD o la secuencia del dominio extracelular del mismo según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo.

25. Polipéptido RTD o secuencia del dominio extracelular del mismo según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o un ácido nucleico según la reivindicación 15 o la reivindicación 16 para uso en terapia.

26. Composición que comprende el polipéptido RTD o la secuencia del dominio extracelular del mismo según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo.

27. Procedimiento para modular la apoptosis in vitro en células de mamíferos que comprende exponer dichas células al polipéptido RTD o la secuencia del dominio extracelular del mismo según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

28. Procedimiento según la reivindicación 27 en el que dichas células se exponen también al ligando Apo-2.

29. Polipéptido RTD o la secuencia del dominio extracelular del mismo según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o un ácido nucleico según la reivindicación 15 o la reivindicación 16 para uso en terapia.

30. Uso de un polipéptido RTD o la secuencia del dominio extracelular del mismo según se define en una cualquiera de la reivindicación 1 a 5, o un ácido nucleico según la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en la preparación de un medicamento para modular la apoptosis en células de mamíferos.