OSTEOPROTEGERINA EN LA LECHE.

Osteoprotegerina obtenida por aislamiento a partir de leche bovina

Osteoprotegerina en la leche.

La presente invención se refiere a la osteoprotegerina procedente de fuentes lácteas, particularmente de la leche bovina. La presente invención también se refiere a su empleo en la elaboración de un preparado ingerible y/o de una composición farmacéutica, en concreto al uso de dicho preparado/composición para evitar o tratar trastornos relacionados con el metabolismo y la función inmune.

En los mamíferos los huesos prestan soporte al cuerpo y están constituidos por minerales, por una matriz de proteínas colágenas y no colágenas, y por material celular. Su crecimiento y mantenimiento está controlado por varios factores involucrados en la regulación e interacción de sus células constituyentes, es decir los condrocitos formadores de cartílago, los osteoblastos que sintetizan y depositan matriz ósea y los osteoclastos responsables de la resorción de material óseo.

Los condrocitos provienen de células mesenquimales y generan un patrón cartilaginoso inicial, necesario para la formación de hueso endocondral. Los osteoblastos, que promueven la formación de tejido óseo, proceden de células mesenquimales osteoprogenitoras y se encuentran en la superficie de los huesos, donde sintetizan, transportan y ordenan las proteínas matriciales. Por otra parte los osteoclastos, que son responsables de la resorción ósea, proceden de precursores de granulocitos-monocitos presentes en la médula hematopoyética. Las acciones de osteoblastos y osteoclastos están estrechamente ligadas, p.ej. los factores proteicos generados durante el proceso de resorción mediado por los osteoclastos actúan como moléculas señalizadoras para iniciar la renovación ósea por medio de los osteoblastos. A su vez los osteoblastos pueden influir en la función osteoblástica mediante la expresión de reguladores solubles o asociados a membrana. Por lo tanto la remodelación ósea normal depende de un equilibrio preciso entre las funciones opuestas de formación y resorción ósea dirigidas por cada uno de los respectivos tipos celulares.

La matriz extracelular almacena factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento fibroblástico (FGF) y el factor de crecimiento transformador (TGF)-ß, y, al secretarlos, estimula la liberación local de células progenitoras de hueso. Después, factores tales como las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs) y la hormona paratiroidea (PTH) influyen en el desarrollo de dichos progenitores hasta osteoblastos, las células formadoras de hueso, cuya diferenciación y función final es regulada por la interacción de la célula con las proteínas de la matriz ósea.

Al envejecer, una persona se ve sometida a una pérdida gradual de masa ósea, un fenómeno llamado desacoplamiento, considerado como el resultado de una mayor actividad de los osteoclastos respecto a los osteoblastos. Cuando este desacoplamiento persiste durante un largo periodo de tiempo, cada vez se destruye/resorbe más material óseo, dando lugar a un estado denominado osteoporosis.

Aparte del fenómeno dependiente de la edad, la pérdida ósea también puede ser debida a una deficiencia de calcio u hormonal, o a estados que causan diversas enfermedades, tales como osteoporosis, hipercalcemia, enfermedad ósea de Paget, pérdida ósea por osteoartritis o artritis reumatoide u osteomielitis y similares. La menor densidad ósea produce generalmente un descenso de resistencia mecánica y una mayor probabilidad de fracturas.

Las propuestas actuales para el tratamiento de la osteoporosis y/o de enfermedades óseas relacionadas incluyen la administración de calcio a la persona que lo precisa. Recientemente también se ha considerado el uso de agentes implicados en la estimulación y/o inhibición de las células óseas, tales como hormonas, calcitonina, factor de crecimiento similar a la insulina u osteoprotegerina (OPG), para tratar los estados patológicos antedichos. En general dichos agentes se obtienen por medios recombinantes y tienen que formularse/prepararse en forma galénica para que la respectiva sustancia pueda alcanzar el objetivo, el hueso, en una forma activa.

La patente WO 00/24771 revela ácidos nucleicos que codifican proteínas análogas a la osteoprotegerina y su uso p.ej. en el tratamiento de la osteoporosis. El polipéptido se sintetiza por medios recombinantes y luego se formula de manera que sea compatible con la ruta de administración pretendida. Como tales se proponen las vías intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (p.ej. inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal.

Generalmente es engorroso y lleva bastante tiempo encontrar una forma galénica adecuada a una sustancia determinada, porque los ingredientes empleados para ello deben ser compatibles con la sustancia activa y también deben proporcionar suficiente protección contra los diversas medios corporales. No obstante, como los agentes estimuladores del crecimiento óseo se sintetizan localmente - en/sobre el tejido óseo - es difícil administrar este tipo de sustancias. Normalmente hay que diseñar cápsulas que ayuden a pasar la sustancia a través del tracto gastrointestinal, sin que se destruya en las condiciones reinantes dentro del mismo. Sin embargo esta vía de administración también tiene algunos inconvenientes, pues la sustancia tiene que atravesar el hígado y ser transportada por fluidos corporales antes de llegar al hueso. Además es frecuente que solo llegue al tejido diana una cantidad reducida de material biológicamente activo.

Por consiguiente un problema de la presente invención es el de facilitar medios para administrar una sustancia activa a una persona, de manera que la sustancia actúe en un tejido específico de dicha persona.

Consecuentemente dicho problema se ha resuelto proporcionando osteoprotegerina según la reivindicación 1.

En las ilustraciones,

La fig. 1 muestra la concentración de osteoprotegerina en la leche materna humana durante varias etapas de lactancia.

La fig. 2 muestra un análisis "Western blot" de fracciones de leche humana en condiciones reductoras usando gel SDS al 10%. Las bandas de OPG se revelaron con el anticuerpo policlonal anti-OPG biotinilado BAF805 de R&D Systems y estreptavidina-fosfatasa alcalina (SAPP).

La fig. 3 muestra el mapa de restricción del plásmido que se integró en el ADN genómico de transformantes de Yarrowia.

La fig. 4 representa un análisis PCR-RT de células de leche materna humana y de células epiteliales de glándula mamaria humana MCF-7; líneas 1 y 2: ß-actina (tamaño de banda esperado: 460 bp); líneas 3 y 4: OPG (tamaño de banda esperado: 603 bp); 1. Células de leche materna humana; 2. MCF-7; 3. Células de leche materna humana; 4. MCF-7.

La fig. 5 muestra los resultados de un experimento en el que la OPG de la presente invención inhibe la apoptosis de células Jurkat inducida por TRAIL.

La osteoprotegerina (OPG), también conocida como factor inhibidor de osteoclastogénesis (OCIF) y molécula similar al receptor de TNF 1 (TR1), es un miembro recientemente descrito de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFR). Inhibe el desarrollo osteoclástico, tanto in vitro como in vivo, e incrementa la densidad ósea (osteopetrosis). En embriones normales de ratón la OPG se ha localizado en los rudimentos cartilaginosos de huesos en desarrollo y también en el intestino delgado.

Sin embargo, a diferencia de otros miembros de la familia de receptores del TNF, la OPG no posee un dominio transmembrana. Además se ha podido demostrar que la OPG también es un receptor del ligando citotóxico TRAIL (ligando inductor de apoptosis relacionada con el TNF) y es idéntica al receptor-1 derivado de células dendríticas foliculares. Como tal se presume que regula la muerte celular y también juega un papel importante en la formación de tejidos linfoides. Justamente se ha demostrado que los animales que carecen de OPG presentan tejidos linfoides subdesarrollados.

En los estudios previos a la presente invención se ha encontrado sorprendentemente que, además de su presencia en los tejidos óseos, p.ej., la osteoprotegerina también puede hallarse en la leche materna humana. Por lo tanto durante la lactancia la madre está aportando obviamente al recién nacido dicha sustancia bioactiva en una forma capaz de perdurar en el tracto gastrointestinal. De ahí se desprende que la OPG producida por las células de las glándulas mamarias difiere indudablemente de la OPG aislada de otras fuentes, por lo que respecta a su estabilidad y/o resistencia a la degradación.