EL RECEPTOR HUMANO H4-1BB HA SIDO AISLADO, SECUENCIADO Y PRESENTADO AQUI.

EL CDNA DEL RECEPTOR HUMANO H4-1BB ES ALREDEDOR DE UN 65% HOMOLOGO CON EL CDNA 4-1BB DEL RATON Y SE AISLO USANDO SONDAS DERIVADAS DEL CDNA 4-1BB. SE HA DESARROLLADO UNA PROTEINA DE FUSION PARA DETECTAR LIGANTES DE LA MEMBRANA CELULAR PARA LA PROTEINA DEL RECEPTOR HUMANO H4-1BB. COMPRENDE LA PARTE EXTRACELULAR DE LA PROTEINA DEL RECEPTOR H4-1BB Y UNA PROTEINA DE DETECCION (FOSFATASA ALCALINA) UNIDA A LA PARTE DE LA PROTEINA DEL RECEPTOR H4-1BB. LAS CELULAS B QUE HAN EXPRESADO UN LIGANTE PARA LA PROTEINA DEL RECEPTOR H4-1BB PUEDEN TRATARSE CON CELULAS QUE HAYAN EXPRESADO LA PROTEINA DEL RECEPTOR H4-1BB Y PUEDE INDUCIRSE LA PROLIFERACION DE LAS CELULAS B. EL USO DEL H4-1BB PARA BLOQUEAR LA UNION DEL LIGANTE H4-1BB TIENE APLICACION PRACTICA EN LA SUPRESION DEL SISTEMA INMUNE DURANTE EL TRASPLANTE DE ORGANOS. UN ANTICUERPO MONOCLONAL CONTRA EL H4-1BB PUEDE UTILIZARSE PARA MEJORAR LA PROLIFERACION DE LAS CELULAS T TRATANDOLAS CELULAS T QUE HAYAN EXPRESADO LA PROTEINA DEL RECEPTOR H4-1BB CON EL ANTICUERPO MONOCLONAL ANTI H4-1BB. LOS TUMORES TRANSFECTADOS CON H4-1BBL PUEDEN SER CAPACES DE SUMINISTRAR SEÑALES ESPECIFICAS PARA EL ANTIGENO ASI COMO LAS SEÑALES COESTIMULATORIAS Y PUEDEN ELIMINARSE MEDIANTE LOS LINFOCITOS HUMANOS, CITOTOXICOS, T

Receptor humano H4-1BB.

La presente solicitud es una continuación en parte de la solicitud, en tramitación con la presente, con Nº de serie 08/012.269, presentada el 1 de febrero de 1993, que es continuación en parte de la solicitud, en tramitación con la presente, con Nº de serie 07/922.996, presentada el 30 de julio de 1992, que es continuación en parte de la solicitud, en tramitación con la presente, con Nº de serie 07/267.577, presentada el 7 de noviembre de 1988.

El objeto descrito en el presente documento fue en parte una invención objeto de las ayudas gubernamentales de los NIH N^os IR23AI23058-03, RO1 AI28175 y P60 KD20542, de las cuales el presente inventor fue el Investigador Principal y el Beneficiario fue o la Donald Guthrie Foundation for Medical Research Inc., de Guthrie Square, Sayre, Pensilvania 18849-1669 o la Facultad de Medicina de la Universidad de Indiana, de Indianápolis, Indiana 46202.

Campo de la presente invención

La presente invención vera acerca de una proteína receptora humana previamente desconocida, H4-1BB, que fue aislada e identificada con base en el trabajo con una proteína receptora homóloga murina (de ratón), 4-1BB, que fue aislada e identificada mediante expresión específica de los genes de las células T por el presente inventor.

Antecedentes de la presente invención

El sistema inmunitario de los seres humanos y de otras especies requiere que los glóbulos blancos se fabriquen en la médula ósea, glóbulos blancos que incluyen fagocitos, linfocitos y células B. Según se entiende en la actualidad, los fagocitos incluyen células macrófagas que eliminan del sistema materiales no deseados, como proteínas víricas. Los linfocitos incluyen células T colaboradoras y células T y células B asesinas, al igual que otras células, incluyendo las catalogadas como células T supresoras. Las células B producen los anticuerpos. Las células T asesinas atraviesan físicamente la célula y las células T colaboradoras facilitan todo el proceso. En cualquier circunstancia, el proceso inmunitario es facilitado por las linfocinas.

Las linfocinas son las proteínas mediante la cual las células inmunitarias se comunican entre sí. Los científicos las producen en cantidades suficientes para su uso terapéutico contra enfermedades inmunológicas. Hay muchas proteínas de linfocinas conocidas, e incluyen los interferones, la interleucina-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, factores estimulantes de colonias, la linfotoxina, el factor de necrosis tumoral y eritropoyetina, al igual que otras.

La interleucina 1, segregada por los macrófagos, activa las células T colaboradoras y eleva la temperatura corporal, causando fiebre, lo que potencia la actividad de las células inmunitarias. Las células T colaboradoras activadas producen interleucina 2, y la interleucina 2 estimula las células T colaboradoras y asesinas para que crezcan y se dividan. Las células T colaboradoras también producen otra linfocina, el factor de crecimiento de las células B (FCCB), que hace que las células B se multipliquen. Según aumenta el número de células B, las células T colaboradoras producen otra linfocina, conocida como factor de diferenciación de las células B (FDCB), que da instrucciones a algunas de las células B para que dejen de replicarse y empiecen a producir anticuerpos. Las células T también producen una linfocina, el interferón (IF) gamma, que tiene múltiples efectos, como la interleucina 2. El interferón contribuye a activar las células T asesinas, capacitándolas para atacar a los organismos invasores. Como el FCCB, el interferón aumenta la capacidad de las células B para producir anticuerpos. El interferón también afecta a los macrófagos para mantenerlos en el lugar de la infección y ayuda a los macrófagos a digerir las células que han rodeado. Cobrando auge con cada tipo de señal de las linfocinas entre los macrófagos y las células T, las linfocinas amplifican la respuesta del sistema inmunitario y la proteína vírica u otra materia extraña en las células infectadas se ven arrolladas. Hay muchas otras linfocinas, quizá cien o más, que participan en el proceso inmunológico. Muchas linfocinas son conocidas; otras muchas no lo son.

Las linfocinas son denominadas a veces señales peptídicas intercelulares. Entre los científicos existe un uso generalizado de líneas celulares clonadas como productoras de linfocinas, y el aislamiento de ARNm de linfocina se ha convertido en una técnica común. La proteína receptora 4-1BB de ratón fue aislada e identificada con base en la expresión específica de los genes de células T usando una técnica identificada por el presente inventor en una publicación (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 2896-2900, mayo de 1987, Immunology and Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 1963-1967, marzo de 1989, Immunology). El protocolo documentado en esa publicación puede ser usado por los científicos para detectar casi todas las linfocinas. El procedimiento está diseñado para detectar casi todo el ARNm expresado de modo diferencial, y las secuencias de ARNm de las células inmunitarias están expresadas diferencialmente (en cuanto a su relación con las células T y las células T asesinas) aunque el nivel de expresión sea bajo y la cantidad de la proteína de linfocina segregada sea reducida. El presente inventor cree que el análisis descrito en la publicación identificada previamente puede revelar moléculas importantes biológicamente, como las linfocinas, porque hay muchas indicaciones de que las moléculas importantes biológicamente o activas son codificadas mediante los mensajes más escasos. Un ejemplo de es un factor de transformación del crecimiento (FTC) que está presente como únicamente uno de un millón de clones.

Clásicamente, la mayoría de los factores de las células T han sido identificados reconociendo las actividades biológicas en los ensayos, purificando la información proteínica. Un enfoque alternativo es aislar los genes putativos de las células T con base en la expresión específica y, a continuación, demostrar la función de la molécula desconocida. Usando el procedimiento de rastreo diferencial modificado mencionado anteriormente, el presente inventor clonó una serie de ADNc específicos a un subconjunto de células T a partir de células T colaboradoras clonadas (HTL) L2 y de linfocitos T citolíticos clonados (LTC) L3.

Se aisló una serie de ADNc específicos a un subconjunto de células T a partir de células T murinas empleando un procedimiento de rastreo diferencial modificado. Se han documentado la secuencia de nucleótidos y las propiedades de expresión de algunas de las especies de ADNc. Se estudió adicionalmente uno de los genes no caracterizados previamente, que codifica la proteína receptora 4-1BB del ratón (Pollok et al., J. Immunol. 150, 771-781, febrero de 1993, y Kim et al., J. Immunol. 151, 1255-1262, agosto de 1993). Estos estudios han llevado al aislamiento del homólogo humano del 4-1BB, H4-1BB.

Resumen de la presente invención

La presente invención incluye la proteína receptora humana H4-1BB que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 1 y un ADNc que codifica dicha proteína receptora humana H4-1BB que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 1. La secuencia de nucleótidos de tal ADNc aislado es dada a conocer en el presente documento (ID SEC Nº 1), junto con la secuencia deducida de aminoácidos. El gen de ADNc, identificado como pH4-1BB, fue depositado en la Colección de Cultivos del Servicio de Investigación Agrícola y se le asignó el número de entrada NRRL B21131.

La presente invención también se relaciona con lo siguiente:

1. Un ADNc que codifica la proteína receptora H4-1BB que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 1.

2. El ADNc de la reivindicación 1 que tiene la secuencia de nucleótidos mostrados en la ID SEC Nº 1.

3. El ADNc de la reivindicación 1, identificado como pH4-1BB, depositado en la Colección de Cultivos del Servicio de Investigación Agrícola con el número de entrada NRRL B21131.

4. Un ADN aislado obtenible mediante amplificación por RCP del ADNc de la reivindicación 2 usando el oligonucleótido 5' AAT AAG CTT TGC TAG TAT CAT ACC T 3' como cebador directo y el oligonucleótido 5' TTA AGA TCT CTG CGG AGA GTG TCC TGG CTC 3' como cebador inverso.

5. La proteína receptora H4-1BB, obtenible

6. La proteína receptora H4-1BB que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 1.

7. Un anticuerpo monoclonal contra H4-1BB que reconoce específicamente la proteína receptora H4-1BB, en el que la H4-1BB tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 1.

8. Un hibridoma capaz de producir un anticuerpo monoclonal contra H4-1BB que reconoce específicamente la proteína receptora H4-1BB, en el que la H4-1BB tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 1.

9. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 7 para su uso como inmunosupresor o inmunoestimulante en seres humanos.

10. Un procedimiento ex vivo para potenciar la proliferación de células T que comprende la etapa de tratamiento de células T que tienen expresada la proteína receptora H4-1BB con el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 7.

11. El procedimiento de la reivindicación 10 que comprende además la etapa de llevar a cabo dicho tratamiento en presencia de la proteína tirosinasa quinasa.

12. Una proteína de fusión que comprende:

en la que la H4-1BB tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 1.

13. La proteína de fusión de la reivindicación 12 en la que dicha proteína de detección es fosfatasa alcalina.

14. Un procedimiento de detección de los ligandos de la membrana celular a la proteína receptora H4-1BB que comprende:

en el que la H4-1BB tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 1.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicha proteína de detección es fosfatasa alcalina.

16. Un procedimiento ex vivo de inducción de la proliferación de células B que comprende la etapa de tratar las células B que tienen expresado un ligando a la proteína receptora H4-1BB con células que tienen expresada la proteína receptora H4-1BB, en el que la H4-1BB tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 1.