REDUCCIÓN DE LA INMUNOGENICIDAD DE LAS PROTEÍNAS DE FUSIÓN.

Método para la reducción de la inmunogenicidad mediante la eliminación de epítopos de células T no propias de una proteína de fusión,

que comprende una primera proteína y una segunda proteína enlazada a dicha primera proteína mediante una unión de fusión; el método comprende una modificación de la secuencia de aminoácidos de la región de unión que rodea dicha unión de fusión, en donde la modificación se realiza mediante uno de los siguientes pasos: (i) introducción de un sitio de glicosilación N-ligada u O-ligada, (ii) reemplazo de una Leu, Val, Ile, Met, Pe, Tir o Trp en los ocho aminoácidos más cercados al extremo Cterminal del compañero de fusión del extremo N-terminal en dicha proteína de fusión con una Tr, Ala o Pro, o (iii) reemplazo de una secuencia de aminoácidos Leu - Ser - Leu - Ser por la secuencia de aminoácidos Ala - Tr - Ala - Tr si la primera proteína es una molécula IgG o un fragmento de la misma

Campo de la Invención

La presente invención hace referencia en general métodos y composiciones para la producción y el uso de proteínas de fusión modificada sin inmunogenicidad o con inmunogenicidad reducida como agentes terapéuticos. 5 Más específicamente, la invención hace referencia a proteínas de fusión, producidas con una menor inmunogenicidad mediante la identificación de los epítopos candidatos de células T y la modificación de la secuencia de aminoácidos para eliminar tales epítopos.

Antecedentes de la Invención

Muchas proteínas terapéuticas son proteínas humanas normales. Por ejemplo, la interleucina-2, la 10 eritropoyetina, y las hormonas del crecimiento son todas proteínas humanas que son suministradas a humanos que ya producen habitualmente niveles endógenos de estas proteínas. En general, las respuestas inmunes contra las proteínas humanas completamente normales son poco frecuentes cuando estas proteínas se utilizan como agentes terapéuticos.

Recientemente se ha vuelto evidente que muchas proteínas de fusión con actividades artificiales son útiles 15 como proteínas terapéuticas. Por ejemplo, Enbrel es una fusión del dominio extracelular de un receptor TNF con una región Fc de la IgG1. Enbrel se utiliza para tratar artritis reumatoide, y se cree que funciona por titulación del TNF y la supresión de la actividad del TNF. Sin embargo, una incidencia significativa de anticuerpos anti-Enbrel se han descubierto en pacientes tratados con Enbrel.

Otro ejemplo de una clase terapéuticamente útil de proteínas de fusión es la inmunocitocinas. Estas 20 proteínas incluyen una fracción de anticuerpo y una fracción de citocina, y son útiles para dirigir las citocinas hacia células enfermas diana, tales como las células cancerosas. Sin embargo, el uso terapéutico de muchas de estas proteínas de fusión es reducido debido a su inmunogenicidad en mamíferos, especialmente en humanos.

La patente WO 02/066514 revela las proteínas de fusión de inmunocitocina con una inmunogenicidad reducida, en donde también la región de unión entre la molécula Ig y la citocina puede ser menos inmunogénica 25 mediante la eliminación de los epítopos de células T de esa región. Sin embargo, este documento no muestra modificaciones específicas dentro de dicha región de unión.

La patente WO 00/34317 muestra un concepto general de reducción de la inmunogenicidad de la proteína mediante la identificación y modificación de los epítopos de células T. Sin embargo, este documento no menciona las proteínas de fusión. 30

Por lo tanto, existe la necesidad de producir proteínas de fusión con una inmunogenicidad reducida a fin de utilizar estas proteínas terapéuticamente.

Resumen de la Invención

La presente invención ofrece métodos y composiciones útiles para la producción de proteínas de fusión con una inmunogenicidad reducida para su uso terapéutico. Por ejemplo, la invención ofrece inmunocitocinas, 35 inmunofusinas, inmunoligandos, otros anticuerpos y proteínas de fusión Fc, proteínas de fusión citocina-citocina, y proteínas de fusión de albúmina con inmunogenicidad disminuida.

La presente invención hace referencia en parte a la percepción de que las proteínas de fusión contienen secuencias que son “no propias." Por ejemplo, incluso en una fusión entre dos proteínas humanas, la región que rodea la unión de fusión comprende una secuencia peptídica que no está habitualmente presente en el cuerpo 40 humano. Por ejemplo, un fármaco proteíco tal como Enbrel se deriva a partir de dos proteínas humanas normales: el receptor TNF y la IgG1. Sin embargo, la unión entre el receptor TNF y la IgG1 es una secuencia peptídica que no se encuentra habitualmente en el cuerpo humano.

Los métodos preferentes de la invención incluyen la reducción de la inmunogenicidad de una proteína de fusión mediante la reducción de la habilidad de un epítopo de unión (péptido de unión) de interactuar con un receptor 45 de células T mediante la reducción de su habilidad de unirse (su afinidad de unión) a las moléculas MHC. De acuerdo con la invención, el epítopo o péptido de unión es preferentemente “no-propio." En general, las proteínas, incluyendo las proteínas terapéuticas, son inmunogénicas, en parte porque las células presentadoras de antígeno endocitan las proteínas y éstas son proteolizadas, y los péptidos resultantes se unen a las moléculas llamadas Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) que presentan los péptidos a la células T. El complejo antigénico 50 péptido-MHC sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno (APC) activa a las células T para proliferar, diferenciar y liberar citocinas. Paralelamente, se induce la diferenciación de células B y la producción de anticuerpos lo que puede además limitar la efectividad de la proteína terapéutica debido a la remoción. De ese modo, el péptido antigénico, si se deriva a partir de una proteína terapéutica, es capaz de inducir una serie de respuestas inmunes

indeseables. La efectividad de la proteína terapéutica se encuentra limitada por los anticuerpos debido a su titulación, y la inducción de respuestas de las células T y las células B es habitualmente perjudicial debido a las reacciones inflamatorias y alérgicas en el paciente.

La presente invención proporciona (1) la identificación de nuevas secuencias de aminoácidos en la región de la unión inmunoglobulina-proteína diana con uno o más epítopos de células T candidatos; y (2) la modificación de 5 estas secuencias de aminoácidos para reducir o eliminar la presencia de péptidos, derivados a partir de la secuencia de unión, que funcionan como epítopos de células T.

La invención proporciona dos clases de composiciones y métodos generales que se relacionan con la reducción de la inmunogenicidad. De acuerdo con una realización de la invención, los epítopos potenciales de células T no propias se identifican en las secuencias que abarcan la unión de fusión. Por ejemplo, los epítopos 10 potenciales de células T no propias se identifican mediante métodos computacionales basados en el modelado de enlace de péptidos a moléculas MHC Clase II. Las sustituciones se realizan, entonces, de modo tal que la habilidad de los péptidos que se derivan a partir de la región de unión para el enlace con MHC Clase II se reduce o se elimina. Este proceso de identificación y modificación de péptidos que se unen a MHC Clase II se denomina “desinmunización” y las moléculas de proteínas modificadas resultantes se denominan “desinmunizadas”. 15

De acuerdo con otra realización de la invención, uno o más sitios de glicosilación se introducen en la unión de fusión. Se utiliza preferentemente un sitio de glicosilación N-ligada, aunque también puede utilizarse un sitio de glicosilación O-ligada. De acuerdo con una realización preferente, los aminoácidos en una región de unión que rodea una unión de fusión de una secuencia de tipo salvaje se mutan de modo que el último aminoácido del compañero de fusión del extremo N-terminal se muta a una asparagina, y los dos primeros aminoácidos del segundo compañero de 20 fusión se mutan a una glicina seguida por una serina o una treonina.

De acuerdo con la invención, se prefiere la eliminación del enlace MHC Clase II en situaciones en donde se producirá una proteína en bacterias o en un organismo que no genere un patrón de glicosilación como en los mamíferos, tales como la levadura o las células de insectos.

Puede preferirse la introducción de sitios de glicosilación cuando la proteína ha de ser producida en una 25 línea celular de mamífero o en una línea celular que crea un patrón de glicosilación que es inocuo para los mamíferos.

En una realización preferente, un componente de la proteína de fusión es una citocina. El término “citocina” se utiliza en la presente para describir proteínas recombinantes o naturales, análogas de éstas, y fragmentos de las mismas que provocan una respuesta específica en una célula que tiene un receptor para esa citocina. 30 Preferentemente, las citocinas son proteínas que pueden ser producidas y excretadas por una célula. Preferentemente, las citocinas incluyen a las Interleucinas tales como Interleucina-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, II-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 y IL-18, factores hematopoyéticos tales como el factor de estimulación de... [Seguir leyendo]

1. Método para la reducción de la inmunogenicidad mediante la eliminación de epítopos de células T no propias de una proteína de fusión, que comprende una primera proteína y una segunda proteína enlazada a dicha primera proteína mediante una unión de fusión; el método comprende una modificación de la secuencia de aminoácidos de la región de unión que rodea dicha unión de fusión, en donde la modificación se realiza mediante uno de los siguientes pasos: 5

(i) introducción de un sitio de glicosilación N-ligada u O-ligada,

(ii) reemplazo de una Leu, Val, Ile, Met, Pe, Tir o Trp en los ocho aminoácidos más cercados al extremo C-terminal del compañero de fusión del extremo N-terminal en dicha proteína de fusión con una Tr, Ala o Pro, o

(iii) reemplazo de una secuencia de aminoácidos Leu - Ser - Leu – Ser por la secuencia de aminoácidos Ala - Tr - Ala – Tr si la primera proteína es una molécula IgG o un fragmento de la misma. 10

2. Método según la reivindicación 1, en donde el paso (i) se logra mediante la introducción del sitio de glicosilación dentro de 10, 5 ó 2 aminoácidos de la unión de fusión.

3. Método según la reivindicación 1, en donde el paso (i) se logra mediante la introducción de una secuencia de aminoácido Asn-X-Ser/Tr, en donde X es cualquier aminoácido.

4. Método según la reivindicación 1, en donde la primera proteína es una molécula Ig o un fragmento de la 15 misma.

5. Método según la reivindicación 1, en donde la primera proteína es una Molécula Ig o un fragmento de la misma y la segunda proteína es una citocina.

6. Método según la reivindicación 5, en donde – a fin de aumentar la vida media en suero – se realiza una mutación adicional entre la IgG- y la fracción citocina de la proteína de fusión mediante el reemplazo de la lisina del 20 extremo C-terminal de la fracción del anticuerpo con una alanina o una leucina.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la región de unión comprende entre 1 y 15 aminoácidos.

8. Método según la reivindicación 7, en donde la región de unión comprende entre 1 y 9 aminoácidos.

9. Proteína de fusión con inmunogenicidad reducida obtenida mediante el método según cualquiera de la 25 reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha proteína de fusión se selecciona entre el grupo que consiste en:

(i) huKs-IL2 que comprende Ala - Tr - Ala – Tr en la secuencia IgG dentro de la región de unión en lugar de Leu -Ser- Leu - Ser, en donde huKS es un anticuerpo dirigido a la molécula de adhesión celular epitelial humana KSA (EP-CAM);

(ii) Fc-IL12-IL2 que comprende Ala – Tr – Ala – Tr en la secuencia IgG dentro de la región de unión en lugar de 30 Leu -Ser - Leu - Ser, en donde Fc es dicha primera proteína y la proteína de fusión IL12-IL2 es dicha segunda proteína;

(iii) proteína de fusión Fc-IL12-L2 que comprende un sitio de glicosilación Asn-Gli en las primeras posiciones dentro de la molécula IL2; en donde la proteína de fusión Fc-IL12 es dicha primera proteína e IL2 es dicha segunda proteína; 35

(vi) Fc-EPO que comprende Ala - Tr-Ala -Tr en la secuencia IgG dentro de la región de unión en lugar de Leu - Ser- Leu – Ser;

(v) Fc-EPO que comprende Ala - Tr - Ala -Tr en la secuencia IgG dentro de la región de unión en lugar de Leu - Ser- Leu – Ser, en donde la cadena Ig es la IgG2 que comprende una región bisagra IgG1.

10. Composición farmacéutica que comprende en una cantidad terapéuticamente efectiva una proteína de 40 fusión según la reivindicación 9 opcionalmente junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

11. Ácido nucleico que codifica una proteína de fusión según la reivindicación 9.