PROCEDIMIENTOS DE DETECCIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO METILADO ANORMALMENTE EN MUESTRAS BIOLÓGICAS HETEROGENEAS.

Método para determinar la presencia de un CpG metilado en un ácido nucleico,

comprendiendo dicho método las etapas siguientes: aislar una muestra heterogénea de ácidos nucleicos que comprende un ácido nucleico diana que contiene CpG a partir de una muestra biológica heterogénea; poner en contacto dicha muestra de ácidos nucleicos con un agente que modifica las citosinas no metiladas; llevar a cabo una reacción de amplificación en dicho ácido nucleico diana utilizando por lo menos un cebador quimérico que comprende una primera parte que no es específica de dicho ácido nucleico diana y una segunda parte situada 3' respecto a dicha primera parte, siendo dicha segunda parte específica para una citosina metilada en dicho ácido nucleico diana; y detectar la presencia de un producto de amplificación para determinar la presencia de un CpG metilado en el ácido nucleico diana, y en el que la reacción de amplificación es una reacción de PCR en la que la secuencia no específica de un cebador quimérico se incorpora en un producto de PCR tras una primera ronda de PCR

Campo de la invención [0001] La invención se refiere de manera general a métodos para detectar indicios de cáncer en muestras biológicas. En particular, la invención se refiere a métodos para detectar la presencia de ácidos nucleicos hipermetilados en muestras biológicas.

Antecedentes de la invención [0002] En eucariotas de orden superior, el ADN puede encontrarse metilado en citosinas situadas 5' respecto a la guanosina en los dinucleótidos CpG. Esta modificación presenta efectos reguladores importantes sobre la expresión génica, especialmente en el caso de que implique áreas ricas en CpG, conocidas como islas CpG (típicamente un contenido de GC de por lo menos 50% en una secuencia de ácidos nucleicos de 200 pares de bases (pb) de longitud) y que con frecuencia se encuentran en las regiones promotoras de muchos genes. La metilación aberrante de islas CpG normalmente no metiladas se ha asociado a la inactivación transcripcional de genes supresores tumorales definidos en cánceres humanos, por ejemplo el cáncer colorrectal (CRC). Otros tipos de cambios de metilación, tales como la pérdida de impronta genética en determinados genes resultante de la hipometilación también se ha relacionado con un riesgo más alto de una diversidad de cánceres, incluyendo el CRC (ver Cui et al., Science 299:1753-55, 14 de marzo de 2003). Por lo tanto, la detección de cambios en la metilación de los ácidos nucleicos puede indicar la aparición o un riesgo muy alto de diversas formas de cánceres. [0003] Se han descrito diversos métodos para detectar cambios de metilación en loci específicos en el ADN genómico. Uno de estos métodos implica la modificación del ADN con bisulfito sódico o un agente comparable que convierte la totalidad de las citosinas no metiladas en uracilos sin convertir las citosinas metiladas, y la amplificación posterior con cebadores específicos para ADN metilado frente a no metilado. Sin embargo, éste y otros métodos de detección de hipermetilación requieren muestras homogéneas de ácidos nucleicos que presentan una cantidad suficiente del ácido nucleico diana. Para muchos tipos de cánceres, resultan necesarios procedimientos invasivos, tales como cirugía, para obtener dicha muestra homogénea. [0004] Sin embargo, muchas muestras biológicas, tales como muestras de heces, son heterogéneas y pueden contener una pequeña cantidad de ácidos nucleicos mutantes mezclados con una gran cantidad de ácidos nucleicos de tipo salvaje. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de métodos para detectar cantidades reducidas de hipermetilación en muestras biológicas heterogéneas. El documento US 2002/025525 da a conocer métodos para detectar la contaminación en diagnósticos moleculares utilizando PCR.

El documento WO 00/26401 se refiere a un método para determinar el estado de metilación del ADN de sitios CpG en un locus dado. Nagasaka et al., Proceedings of the Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, New York, NY, US, vol. 43, marzo de 2002, página 1129, da a conocer una micromatriz de islas CpG para analizar los perfiles de metilación de 6-metilguanina-ADNmetiltransferasa en el cáncer de colon. El documento WO 01/75172 da a conocer un ensayo diagnóstico o pronóstico para el adenocarcinoma gastrointestinal. El documento WO 02/18649 da a conocer un método de detección del cáncer mediante la reacción en cadena de la polimerasa anidada específica de metilación. Bevilacqua et al., International Journal of Cancer, NY, US, vol. 87, enero de 2000, páginas 200 a 203, da a conocer la metilación del promotor hMLH1 pero no mutaciones de hMLH1 en carcinomas gástricos esporádicos con elevada inestabilidad de microsatélites. Moinova et al., PNAS 99(7):4562-4567, 2 de abril de 2002, se refiere al silenciamiento génico HLTF en el cáncer de colon humano. Hiltunen et al., International Journal of Cancer, NY, US, 70(6):644-648, 17 de marzo de 1997, se refiere a la hipermetilación de la región promotora del gen APC (poliposis coli adenomatosa) en el carcinoma colorrectal humano.

Descripción resumida de la invención [0005] Los métodos de la invención hacen posible detectar una enfermedad en una muestra biológica sin utilizar procedimientos invasivos. Según la invención, mediante la realización de un ensayo para detectar los cambios de metilación en una muestra heterogénea de ácidos nucleicos, tal como una muestra obtenida de heces, pueden detectarse cantidades reducidas de ácidos nucleicos con metilación anormal que son indicativas de la presencia de una enfermedad, por ejemplo cáncer o precáncer, en un paciente. En un aspecto, los métodos de la invención implican detectar la presencia de cantidades reducidas de ácidos nucleicos hipermetilados en una muestra heterogénea que contiene cantidades elevadas de ácidos nucleicos no metilados, utilizando reacciones de amplificación de ácidos nucleicos altamente sensibles y específicas. En otro aspecto, los métodos de la invención implican detectar la presencia de cambios pequeños en la cantidad de ácido nucleico hipometilado en una muestra heterogénea que contiene ácidos nucleicos tanto metilados como no metilados, utilizando reacciones de amplificación de ácidos nucleicos altamente sensibles y específicas. En aspectos adicionales, los métodos de la invención pueden detectar la hipermetilación o la hipometilación en una combinación de dos o más marcadores o loci CpG diana para mejorar la fiabilidad de la detección de enfermedades. [0006] En un aspecto, los métodos de la invención comprenden la utilización de cebadores

mejorados para detectar la hipermetilación o hipometilación en un ácido nucleico diana. En una realización preferente, los métodos de la invención comprenden llevar a cabo una amplificación de ácidos nucleicos utilizando uno o más (preferentemente dos) cebadores quiméricos. Un cebador quimérico, para los fines de la invención, es un cebador que presenta una parte 3' con una especificidad de secuencia sustancial para el molde diana que debe amplificarse (una parte específica de molde) y una parte 5' que se denomina en la presente memoria "parte no específica" que no se hibrida con el molde diana. La secuencia 5' no específica preferentemente incluye por lo menos 5, y preferentemente 30 ó menos nucleótidos. Además, la parte 5' no específica preferentemente presenta un contenido de G-C de por lo menos 50%. En una realización particularmente preferente, la parte 5' no específica de los cebadores tanto directo como inverso es la misma. Los cebadores pueden incluir ADN, ARN o un análogo de ácidos nucleicos, tal como APN. En una realización preferente, el ácido nucleico diana se aísla a partir de una muestra de heces. [0007] En otro aspecto, los métodos de la invención comprenden la optimización de las condiciones de reacción para que la PCR detecte la metilación anormal en una subpoblación de ácidos nucleicos en una muestra biológica. En una realización preferente, los métodos de la invención comprenden determinar una primera temperatura de fusión para un cebador en una PCR que amplifica un ácido nucleico diana, y llevar a cabo una PCR a una segunda temperatura de fusión que es más alta que la primera temperatura de fusión, utilizando por lo menos un cebador quimérico. La temperatura de fusión, en ocasiones denominada temperatura de hibridación, tal como se denomina en la presente memoria, se refiere a la temperatura a la que las cadenas de un ácido nucleico híbrido se encuentran disociadas aproximadamente al 50%. La segunda temperatura de fusión preferentemente es aproximadamente 3ºC más alta que la primera temperatura de fusión. En una realización altamente preferente, la segunda temperatura de fusión es aproximadamente 65ºC. [0008] En otro aspecto, la invención proporciona métodos para cribar una población para detectar pacientes que presentan indicios de cáncer. En realizaciones preferentes, se interroga una pluralidad de regiones que contienen CpG diana para la presencia de hipermetilación o hipometilación. Preferentemente, se someten a ensayo una o más regiones asociadas a los genes siguientes, en ácidos nucleicos procedentes del paciente aislados a partir de una muestra biológica heterogénea, tal como heces: regiones reguladoras de poliposis coli adenomatosa (APC), proteína 1 de hipermetilación en el cáncer (HIC1), proteína 14 (p14), proteína 16 (p16), O(6)-metilguanina-ADN-metiltransferasa (MGMT), factor de transcripción de tipo helicasa (HLTF), proteína diana nuclear 1 de interacción con Msx2 (MINT1), proteína diana nuclear 2 de interacción con Msx2 (MINT2), proteína diana nuclear 31 de interacción con Msx2 (MINT31), homólogo 1 de mut-L humano (hMLH1), trombospondina 1 (THBS1),...

1. Método para determinar la presencia de un CpG metilado en un ácido nucleico, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

aislar una muestra heterogénea de ácidos nucleicos que comprende un ácido nucleico diana que contiene CpG a partir de una muestra biológica heterogénea; poner en contacto dicha muestra de ácidos nucleicos con un agente que modifica las citosinas no metiladas;

llevar a cabo una reacción de amplificación en dicho ácido nucleico diana utilizando por lo menos un cebador quimérico que comprende una primera parte que no es específica de dicho ácido nucleico diana y una segunda parte situada 3' respecto a dicha primera parte, siendo dicha segunda parte específica para una citosina metilada en dicho ácido nucleico diana; y

detectar la presencia de un producto de amplificación para determinar la presencia de un CpG metilado en el ácido nucleico diana, y

en el que la reacción de amplificación es una reacción de PCR en la que la secuencia no específica de un cebador quimérico se incorpora en un producto de PCR tras una primera ronda de PCR.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa de aislamiento comprende la captura híbrida especifica de una secuencia.

3. Método según la reivindicación 1, en el que dicha primera parte comprende por lo menos 5, aunque menos de aproximadamente 30 nucleótidos o aproximadamente 30 nucleótidos.

4. Método según la reivindicación 1, en el que dicha segunda parte comprende entre aproximadamente 10 y aproximadamente 30 nucleótidos.

5. Método según la reivindicación 1, en el que se utilizan por lo menos dos cebadores quiméricos, y en el que cada uno de dichos por lo menos dos cebadores presenta una primera parte idéntica.

6. Método según la reivindicación 1, en el que dicha primera parte presenta un contenido de G-C de por lo menos 50%.

7. Método según la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico diana se selecciona de entre el grupo que consiste de ADN, ARN y un análogo de ácido nucleico.

8. Método según la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico diana es de doble cadena.

9. Método según la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico diana es por lo menos una parte de un gen seleccionado de entre el grupo que consiste del gen poliposis adenomatosis coli (APC), p16, hMLH1, MGMT, H1C1, p14, HLTF, MINT2 y MINT31.

10. Utilización del método según la reivindicación 1 para el cribado de una población de pacientes para un indicio de cáncer o precáncer colorrectal, comprendiendo el método las etapas siguientes:

proporcionar una pluralidad de ácidos nucleicos molde diana aislado de cada pa

ciente; y

someter a ensayo cada uno de dichos moldes para la presencia de hipermetilación

según el método según la reivindicación 1.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra biológica heterogénea es una muestra de heces.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho ácido nucleico diana es por lo menos una parte de un gen de poliposis adenomatosa coli (APC) humana.

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho ácido nucleico diana es por lo menos una parte de un gen HTLF.