SISTEMA PARA LA VALIDACION CUANTITATIVA Y CUALITATIVA INTERNA DE INDICES DE MARCADORES.

Un pseudo-tejido que comprende una mezcla sustancialmente homogénea de dos o más poblaciones de células de células fijas incluidas en una matriz,

estando dicha matriz construida a partir de un material seleccionado del grupo que consiste en plásticos, parafina o derivados de parafina, agarosa, suero sin heparina, colágeno, derivados de celulosa, derivados de quitina, derivados de quitosano y mezclas de los mismos, en el que cada una de dichas poblaciones de células se obtiene a partir de una única línea de células y comprende células que son sustancialmente idénticas unas a otras con respecto al número de uno o más marcador(es) seleccionados del grupo que consiste en marcadores de la proliferación, receptores de hormonas, compuestos del citoesqueleto, marcadores hematológicos, productos oncógenos, receptores nucleares, aberraciones cromosómicas y agentes infecciosos, y en el que dichas dos o más poblaciones de células difieren una de otra en que las células de una población no son sustancialmente idénticas a las células de otra población con respecto al número de dicho uno o más marcador(es) específicos, en el que dichas células de dicha una o más poblaciones de células están fijas con anterioridad a su incorporación en la matriz

Sistema para la validación cuantitativa y cualitativa interna de índices de marcadores.

Campo de la técnica

La presente invención se refiere a una herramienta para su uso en la validación cualitativa y cuantitativa de índices de marcadores, especialmente para la diagnosis médica, la prognosis y de relevancia terapéutica tales como para la determinación de la fracción de crecimiento en una muestra con anticuerpos frente a la proteína K-67.

Técnica anterior

La determinación de marcadores y de índices de marcadores es un componente integral de la diagnosis médica moderna en los más variados campos médicos. Por consiguiente, por ejemplo, la determinación de la relación de la lipoproteína de alta densidad (HDL) a la lipoproteína de baja densidad (LDL) es parte de la rutina de los análisis de sangre; la determinación de la relación de células sanguíneas positivas CD4 a CD8 es uno de los parámetros más importantes en la diagnosis del SIDA; en la diagnosis de tumores, por ejemplo en el cáncer de pecho, la determinación del estado del receptor de la hormona se considera que es un indicador para el tratamiento que sigue a una operación. Debido a que las más variadas estructuras sirven como marcadores, los métodos de determinación son también diversos: ELISA, RIA, valoraciones químicas y/o bioquímicas, FACS, análisis luminométricos, nefelométricos, densitométricos, etc., los cuales son bien conocidos por las personas especializadas.

En la diagnosis de tumores, el examen de una sección de tejido fina y/o el examen citológico de una muestra es todavía el método de elección. Para este propósito, el patólogo experimentado aplica métodos histoquímicos, e inmunohistoquímicos y/o citoquímicos e inmunocitoquímicos en un grado creciente. Así, el estado del receptor de la hormona mencionado anteriormente se determina inmunohistológicamente y/o inmunocitológicamente en el cáncer de pecho. (En lo sucesivo, el término inmunohistoquímico abarca el inmunohistológico así como también el inmunocitológico). En todas las determinaciones del marcador, la persona especializada se debe asegurar de que los sistemas de ensayo sean capaces de ser validados cualitativa y cuantitativamente. La validación de algunos marcadores se puede efectuar mediante su calibrado frente a un patrón interno o externo y la generación de curvas de calibrado a través de medidas paralelas frente a controles positivos y negativos. Sin embargo, generalmente estos métodos de validación son muy caros y de larga duración.

En inmunohistoquímica, una validación tal, y especialmente una validación cuantitativa, no es un asunto trivial, debido a que los estuches (kits) comerciales para la representación del marcador inmunohistoquímico bien no contienen en modo alguno un control interno o, por ejemplo como sucede con el receptor de la hormona, contienen preparaciones celulares que son bien positivas o bien negativas, es decir sólo permiten una decisión de sí/no y por lo tanto sólo se pueden considerar en el mejor de los casos como una validación semi-cuantitativa.

En un estuche HercpTest^TM Code Nº K 5204 de tinción inmunocitoquímica comercializado por DAKO, se conoce que dispone de un portaobjetos de control para la validación de una operación de tinción para un cáncer de pecho. Este portaobjetos de control comprende tres grupos discretos y no mezclados de células de línea de células (tipos de células específicas) con una puntuación de intensidad conocida. Mediante el control de si los grupos de células de línea de células proporcionan los resultados previamente conocidos en un procedimiento de tinción, se puede validar el procedimiento de tinción.

Así, en la práctica, el patólogo experimentado realiza una determinación paralela del marcador a examinar sobre casos bien caracterizados y ensayados previamente procedentes de su archivo. Este método es, por una parte, técnicamente incierto o al menos sujeto a controversia como consecuencia de la conocida heterogeneidad de los tejidos y, por otra parte, éticamente cuestionable, lo que hace imposible una realización comercial de este procedimiento.

Desde el principio del siglo 20, los parámetros para la determinación de la actividad de proliferación han sido ya un componente integral en la diagnosis histopatológica de tumores. Inmunohistológicamente, el retrato de las estructuras que controlan el ciclo de división celular se usa como marcadores de la proliferación. Muchas de las proteínas asociadas al ciclo celular participantes se expresan momentáneamente en fases de ciclo celular único. En contraste con esto, la proteína nuclear Ki-67 (Gerdes, J., y colaboradores., Int. J. Cancer, 1983, 31: 13-20) es detectable en todas las fases activas del ciclo celular, es decir G1, S, G2 y en la mitosis, mientras que las células de la fase restante (GO) son consistentemente negativas para esta proteína (Gerdes, J., y colaboradores., J. Immunol., 1984, 133: 1710-1715). Esto significa que la expresión de la proteína Ki-67 (índice marcador Ki-67) puede servir como una medida para la fracción de crecimiento de una población celular dada. Por esto, los anticuerpos frente a la proteína Ki-67 han encontrado un amplio uso en histopatología, especialmente en numerosos estudios sobre el uso como un marcador para la evaluación de la malignidad en las neoplasias humanas (Sawhney, N. y Hall, P. A., J. Pathol, 1992, 168:161-162; Schwarting, R., Lab. Invest., 1993, 68:579-599; Lelle, R. J., y colaboradores., Cancer, 1987, 59:83-88; Lokhorst, H. M., y colaboradores., J. Clin. Invest, 1987, 79:1401-1411; Gerdes, J. y colaboradores., Am. J. Path., 1987, 128:330-334 y 129:486-492).

En estudios retrospectivos sobre diversas entidades de tumos, el papel del índice de marcador de la Ki-67 como un marcador de la prognosis se trata de una manera diferente. Mientras que se describió una unánime correlación entre el tiempo de supervivencia de los pacientes y el índice del marcador Ki-67 para los linfomas del tipo no de Hodgkinn malignos (Gerdes, J. y colaboradores., 1987, Lancet, ii 448-449; Grogan, T. M. y colaboradores., 1988 Blood, 71:-1157-1160; Hall, P. A. y colaboradores., J. Pathol. 1988, 154:223-235), esto se ha tratado de forma controvertida en parte para el cáncer de pecho: Harberg y colaboradores (Prognostic and relevant therapy factors in breast cancer, Novartis Pharma Publishers, Nürnberg, 1997) no encontraron correlación en un análisis multivariante, mientras que Querzoli, P. y colaboradores., J. Clin. Pathol. Noviembre de 1996, 49(11): 926-930; Veronese, S. M. y colaboradores., Anicancer Res. Noviembre de 1995, 15(6B): 2717-2722; Clahsen, P. C. y colaboradores., J. Clin. Oncol.. Febrero de 1998, 16(2): 470-479; Rozan, S. y colaboradores., Int. J. Cancer Febrero de 1998, 79(1):27-33; Jansen R. L. y colaboradores., Br. J. Cancer Agosto de 1998, 78(4):433-437; probaron de un modo concluyente que el retrato de la proteína Ki-67 en secciones de parafina con el anti-cuerpo monoclonal MIB-1 en el análisis estadístico multivariante es un parámetro de pronostico independiente en el cáncer de pecho. Aaltoma y colaboradores., 1997, Eur. Urol. 32: 410-415 y Borre y colaboradores., 1998, J. Urol. 159. 1609-1614, demostraron que el índice del marcador Ki-67 es también un parámetro de pronostico independiente para el carcinoma de próstata, mientras que Coetze y colaboradores., 1997, J. Urol. 157: 214-218, cuestionaron el valor del índice de marcador Ki-67 como un indicador para el pronóstico, y Uzoaru y colaboradores., 1998, J. Surg. Oncol. 67: 33-37, incluso concluyeron que el índice de marcador Ki-67 no permite cualquier prognosis significativa en lo que respecta a la supervivencia de los pacientes.

Como se demostró anteriormente por medio del ejemplo sobre los receptores de la hormona, una normalización de las técnicas de inmunotinción así como también una validación interna del análisis cuantitativo no ha sido posible hasta ahora incluso con la promoción del índice de marcador Ki-67.

Sumario de la Invención

Por lo tanto, un objeto de la invención es proporcionar una herramienta para su uso en la validación cualitativa y/o cuantitativa de los índices de marcador, especialmente en la prognosis médica, la diagnosis, tal como en la diagnosis inmunohistoquímica, y especialmente para la validación de un índice marcador Ki-67, y en la determinación de la relevancia terapéutica.

Un objetivo adicional de la invención es proporcionar una herramienta para la validación de índices marcadores, la cual herramienta es relativamente rápida y fácil de usar y puede proporcionar un resultado fiable.