Procedimiento y dispositivo de análisis in vitro de mRNA de genes implicados en neoplasias hematológicas.

El dispositivo, compuesto de sondas que hibridan de forma específica con genes implicados en neoplasias hematológicas, diseñadas para que su comportamiento en la hibridación sea similar, permite la evaluación del nivel de mRNA en muestras biológicas extraídas de sujetos que se sospecha que pueden padecer una neoplasia hematológica y facilita la comparación entre las distintas muestras y su agrupamiento por similitud en los patrones de expresión de los genes, especialmente cuando las sondas están dispuestas en forma de microarray. La aplicación del método de la invención para obtener y procesar datos de diferencias en expresión génica procedentes del dispositivo de la invención permite la identificación de genes significativos para distinguir muestras asociadas a neoplasias hematológicas, facilita el diagnóstico de neoplasias como la LLC y permite incluso pronosticar la evolución de la misma

Procedimiento y dispositivo de análisis in vitro de mRNA de genes implicados en neoplasias hematológicas.

Campo de la invención

La invención se adscribe al sector técnico-industrial del diagnóstico in vitro, extracorpóreo, de muestras biológicas, mediante técnicas de ingeniería genética, aplicado al diagnóstico de tipos concretos de neoplasias a partir de sus patrones de expresión génica y/o al pronóstico de su evolución. Más concretamente, la invención se refiere a la identificación de neoplasias originadas a partir de células hematopoyéticas a partir de la evaluación de los niveles de RNA mensajeros de genes significativos en muestras biológicas como pueden ser las muestras de sangre periférica, preferiblemente mediante el uso de microarrays. Con ello pueden identificarse muestras correspondientes a pacientes que padecen LLC, permitiendo el diagnóstico de la misma y, además, pueden clasificarse muestras de pacientes que padecen LLC en muestras que pertenecen a pacientes en los que la LLC va a permanecer estable o en los que va a progresar, permitiendo el pronóstico de la futura evolución de estos pacientes.

Antecedentes de la invención

Cada día, el cuerpo humano produce billones de nuevas células blancas, rojas y plaquetas que reemplazan a las células hematopoyéticas que se pierden como consecuencia de un proceso normal de renovación, enfermedad o trauma. Al proceso organizado de producción de células hematopoyéticas y homeostasis se le conoce con el nombre de hematopoyesis (Weissman IL et al., 2000; Leung AYH et al., 2005.

En el hombre la hematopoyesis está confinada a la médula ósea (M.O.) de la mayor parte de los huesos, y de forma gradual, con la edad, ésta es sustituida por grasa de manera que, en el adulto, el 70% de la médula ósea se localiza en pelvis, vértebras y esternón (Bernard et al., 1976).

Todas las células maduras de la sangre se generan a partir de un relativo bajo número de células hematopoyéticas conocidas como células hematopoyéticas madre o "stem". La célula madre hematopoyética tiene dos características que son la pluripotencialidad o capacidad de dar origen a las distintas estirpes celulares hematopoyéticas y la autorrenovación o propiedad de perpetuarse generando células iguales a si misma (Weissman IL et al., 2000). Esta capacidad es esencial para el mantenimiento de la hematopoyesis a lo largo de la vida ya que, sin la autorrenovación, se agotaría rápidamente la reserva de células madre disponible. Las células madre hematopoyéticas son capaces de generar distintos tipos celulares hematopoyéticos maduros a través de una serie de progenitores y precursores intermedios. Estos progenitores y precursores sufren una secuencia ordenada de sucesos que los transforman en células maduras. A este proceso se le conoce con el nombre de diferenciación (Lee MF et al., 2005). La diferenciación de las células hematopoyéticas implica cambios que afectan entre otros al tamaño y forma de la célula, a la expresión de genes, de proteínas, respuesta a señales y localización de las células.

Las células terminalmente diferenciadas han perdido su capacidad de división y sufren apoptosis después de un periodo de tiempo que va desde horas para neutrófilos hasta décadas para algunos linfocitos. Este hecho hace que la M.O. deba asegurar constantemente el recambio celular (Datta SR et al., 1999).

El proceso de hematopoyesis comprende una compleja interacción entre acontecimientos genéticos intrínsecos de las células hematopoyéticas y ambiente en el que se encuentran. Esta interacción es la que determina si los precursores y progenitores hematopoyéticos se deben mantener quiescentes, proliferar, diferenciarse en una u otra línea o entrar en apoptosis (Domen J et al., 1999). Todos los mecanismos genéticos y ambientales que gobiernan la producción de células sanguíneas operan alterando la balanza relativa de estos procesos celulares fundamentales.

Los factores ambientales y genéticos son críticos en hematopoyesis. Así por ejemplo la expresión de genes pertenecientes a las familias Rb (Bergh et al., 1999), ciclinas (Della Ragione F et al., 1997) o Hox (Magli MC et al., 1997) regulan la proliferación de células hematopoyéticas en estadios tempranas de diferenciación. Los genes de la familia de bcl-2 regulan apoptosis en células hematopoyéticas (O'Gorman DM et al., 2001). Una gran variedad de genes entre los que se encuentran C/EBP (Tenen DG et al., 1997), Pax5 (Nutt SL et al., 1999) e Ikaros (Nichogiannopoulou A. et al., 1998) parecen estar implicados en diferenciación hematopoyética y compromiso de línea.

Neoplasias hematológicas

Las neoplasias hematológicas son procesos malignos que afectan a cualquiera de los tipos celulares implicados en el sistema hematopoyético. Como consecuencia de esta transformación, la célula es bloqueada en un estadio de diferenciación y comienza a acumularse debido a una proliferación incontrolada, a un fallo del mecanismo apoptótico o a un bloqueo de su proceso de diferenciación.

La transformación maligna de las células hematopoyéticas durante los diferentes estadios por los que atraviesan en su diferenciación a células maduras origina un gran número de neoplasias distintas (Guttmacher AE et al., 2003). Este tipo de neoplasias es por tanto un grupo muy heterogéneo de enfermedades que sólo tiene en común el origen hematopoyético del tipo celular transformado.

Clasificación de las neoplasias hematológicas

Genéricamente podrían establecerse dos grandes grupos: las neoplasias linfoides que afectan a los distintos tipos celulares y grados madurativos que conforman la línea linfoide tanto B como T y el otro gran grupo lo constituyen las neoplasias mieloides que afectan a diversos tipos celulares de la línea mieloide. Sin embargo, esta clasificación simplista actualmente está mas desarrollada, tal y como se detalla más abajo.

Desde el punto de vista clínico, clásicamente se han diferenciado de manera arbitraria las leucemias de los linfomas, señalando a las leucemias como aquellas neoplasias que afectan a la médula ósea y tienen expresión periférica, es decir, circulación de células anómalas en sangre, y a los linfomas como aquellas neoplasias que permanecen localizadas en los ganglios linfáticos u otros tejidos linfoides y que carecen, al menos de manera inicial, de comportamiento leucémico. En el caso de las leucemias, se ha diferenciado los procesos agudos de los crónicos inicialmente por las características morfo-citológicas de las células proliferantes (inmaduras y atípicas en el primer caso y más diferenciadas en el segundo) y a las manifestaciones clínicas de la enfermedad. En la actualidad el conocimiento de los marcadores inmunológicos y las alteraciones genéticas que afectan a las células hematopoyéticas ayudan a diferenciar con más precisión los diferentes procesos.

Hoy se conoce que las neoplasias hematológicas, al igual que ocurre en otros tipos de cáncer, tienen un origen multigénico. La gran revolución tecnológica producida en los últimos años ha supuesto conocer las bases moleculares de varias neoplasias. La utilización de estas técnicas permite identificar genes relevantes en el cáncer humano, confirmar los resultados obtenidos en investigación básica en modelos animales, establecer patrones de susceptibilidad, clasificar de forma más precisa las neoplasias, mejorar el diagnóstico de la enfermedad, identificar nuevas dianas terapéuticas y mejorar la selección terapéutica para cada paciente.

También la diversidad que existe entre los individuos es importante y tiene su repercusión clínica, basada en las diferencias genéticas: si somos capaces de reconocer estas diferencias genéticas seremos también capaces de avanzar en conocer toxicidad y diferencias en la respuesta al tratamiento. (Westbrook CA et al., 2005).

En 1995, la Organización Mundial de la Salud (OMS/WHO) en colaboración con la Asociación Europea de Hematología y patólogos, clínicos y científicos de todo el mundo, inició un proyecto con el objetivo de obtener una clasificación consensuada de los tumores del tejido hematopoyético y órganos linfoides. Este proyecto condujo al desarrollo de un sistema de definición, clasificación y establecimiento de criterios diagnósticos consenso para las neoplasias mieloides, linfoides e histiocitarias (Jaffe ES et al., 2001). Los criterios de clasificación de la OMS son los mismos que se utilizaron...

1. Composición que comprende al menos los oligonucleótidos del grupo: SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 216 y SEQ ID NO: 366 ó 367.

2. Composición, según la reivindicación 1, que además comprende al menos uno o la totalidad de los oligonucleótidos del grupo: SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 293 ó 305, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 555 y SEQ ID NO: 556.

3. Composición, según la reivindicación 1, que además comprende los oligonucleótidos del grupo: SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 507 y SEQ ID NO: 508.

4. Composición, según la reivindicación 3, que además comprende los oligonucleótidos del grupo: SEQ ID NO: 461 y SEQ ID NO: 493.

5. Composición, según la reivindicación 3, que además comprende el oligonucleótido de SEQ ID NO: 237.

6. Composición, según las reivindicaciones 1 a 5, que comprende la totalidad de los oligonucleótidos del grupo: SEQ ID NO: 1-462, 465, 468-563.

7. Composición, según las reivindicaciones 1 a 6, que además comprende la pareja de oligonucleótidos SEQ ID NO: 463 y SEQ ID NO: 464 y/o la pareja de oligonucleótidos SEQ ID NO: 466 y SEQ ID NO: 467.

8. Composición, según las reivindicaciones 1 a 6, que además comprende al menos uno o la totalidad de los oligonucleótidos del grupo: SEQ ID NO: 584-590.

9. Composición, según las reivindicaciones 1 a 6, que además comprende al menos uno o la totalidad de los oligonucleótidos del grupo: SEQ ID NO: 572, SEQ ID NO: 573, SEQ ID NO: 576, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 581, SEQ ID NO: 582 y SEQ ID NO: 583.

10. Composición, según las reivindicaciones 1 a 6, que además comprende al menos uno o la totalidad de los oligonucleótidos del grupo: SEQ ID NO: 571, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 577, SEQ ID NO: 580, SEQ ID NO: 564, SEQ ID NO: 565, SEQ ID NO: 566, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 569 y SEQ ID NO: 570.

11. Microarray que comprende la composición de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Uso del microarray de la reivindicación 11 para el diagnóstico y/o pronóstico in vitro de la evolución de neoplasias originadas a partir de células hematopoyéticas, preferentemente leucemia linfática crónica.

13. Método in vitro para el diagnóstico y/o pronóstico de neoplasias originadas a partir de células hematopoyéticas, preferentemente leucemia linfática crónica, que comprende la estimación del nivel de expresión de al menos el grupo de genes comprendido por: PSMB4, FCER2 o CD23A y POU2F2 empleando la composición de la reivindicación 1.

14. Método, según la reivindicación 13, que además comprende la estimación del nivel de expresión del al menos uno, o de la totalidad, de los genes: ODC1, CD79A, CD2, CD3E, CDS, MS4A1, EIF4E, FHIT, NR3C1, LCP1, MAPK10, ABCC5, XRCC3, CML66, PLZF y RBP4 empleando la composición de la reivindicación 2.

15. Método, según la reivindicación 13, que además comprende la estimación del nivel de expresión del grupo de genes: CD79A, FAIM3, HLA-DRA, HLA-DRB3 y HLA-DQA1 empleando la composición de la reivindicación 3.

16. Método, según la reivindicación 15, que además comprende la estimación del nivel de expresión de al menos los genes IRF8 y COL3A1 empleando la composición de la reivindicación 4.

17. Método, según la reivindicación 15, que además comprende la estimación del nivel de expresión de al menos el gen CDW52 empleando la composición de la reivindicación 5.

18. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 13-17, comprende la estimación del nivel de expresión grupo de genes: 18S rRNA, PSMB4, FCER2 o CD23A, POU2F2, ODC1, CD79A, CD2, CD3E, CDS, MS4A1, FHIT, NR3C1, LCP1, MAPK10, ABCC5, XRCC3, CML66, PLZF, RBP4, CEBPD, FAIM3, HLA-DRA, HLA-DRB3, HLA-DQA1, IRF8, COL3A1, CDW52, GABARAP, IGLV6-57, PCD, NCALD, DLAD, SOSTDC1, TIA-2, PYGB, LIMS1, ABL1, DRG1, BRMSI, ABHD1, IFRD1, RPL36A, IGFBP2, NDRG1, FKBP9, NDP52, FABP5, FARP1, PGF, GDI2, BLVRB, TACSTD2, TCEB1, EEF1A1, H3F3A, IGFBP3, NCL, RPL24, GJA1, GUSB, HSD17B1, SFTPB, RPL23A, CSRP2, CXADR, EEFIG, CKS2, COL4A6, CRYAB, CYC1, FNTB, GOT1, LGALS7, SERPINBS, PSMC5, PTN, RBBP8, RXRA, SDHD, SEPW1, SSBP1, TEGT, HISTIH2BN, BECN1, ANXA7, NDUFA1, ARHGEF2, C5orfl3, XBP1, GIP2, GLUD1, S100A2, LASP1, PGRMCI, ZFPL1, MAP4K1, HNRPH3, TMEM4, KIAA0247, RIS1, ARS2, CAl2, EEF1B2, TRIB2, FLJ22169, ASNS, WBSCR20C, AKR1A1, SPRR1A, EFNB1, RPS5, RPS9, RPL17, EIF4B, ZYX, XPO6, LOC285148, C21orf33, EEF1D, PABPC1, RBBP6, HRAS, GGA3, CFL1, EIF3S2, KRT18, IGFIR, ILB, IRF1, IRF2, LYN, LYZ, NFKBIA, MAZ, MCM3, MEIS1, PRTN3, MMP2, MMP7, MMP8, DOK1, PDGFA, PRL, RAF1, RARB, OPRD1, RET, SREBF1, TNF, TERF1, VCAM1, ATPSO, TNFSF5, POLR2C, PLA2G6, CCT6A, PDHA1, LADH, SNRPB, H2AFX, MRPL37, UBE2C, RPS3, ALDHIA1, AF1q, RUNX1, MYBL1, ANXA6, ALK, MNDA, APAF1, BIRC3, ABCC6, ATIC, ATM, BAX, CCND1, BCL2, BCL3, BCL6, BCL7A, BCL7b, BCL10, BCL2L1, BCR, OLIG2, BIK, BCL2LAA, BMI1, BLMH, BLR1, IBSP, BTG1, BUB1, CASP1, CASP3, CASP4, CASP5, CASP6, CASP7, CASP8, CASP9, CBFB, CALD1, CAST, CDC25A, CDC25B, CD4, CD6, CD7, CD8, CD9, MME, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ANPEP, CD14, SELE, FCGR3A, FCGR3B, ITGB2, CD19, CR2, CD22, CD24, IL2RA, DPP4, ITGB1, TNFRSF8, CD33, CD34, CD36, CD38, TNFRSF5, SPN, CD44, CD44v6, PTPRCCD, CD47, ITGA2, ITGA3, ITGA4, ITGAS, ICAM3, ICAM1, NCAM1, CD58, CD59, SELL, CD79B, CD81, KAI1, CD83, CD86, TNFRSF6, TNFSF6, SLC7A5, SDC1, CDK4, STAT3, FGR, FOS, CCNE1, CDA, MAFB, MPL, MYC, MYB, CKMT1, CREBBP, CTGF, CXCR3, CXCR4, CCNA1, CCNB1, CCND2, CYP1A1, CYP2A6, DAD-1, TNFRSF10C, DEK, DCK, DHFR, TCF3, E2F1, EB-1, CCR7, EBI2, MUC- 1, EphA3, EPOR, ERCC1, ERCC2, ERCC3, ERCC5, ERCC6, CUZD1, ETV6, EIF4E, EIFSA, EZH2, FADD, PTK2, FAT, FGFR1, FGFR3, FLT3, GRIA3, FUS, SIAT4A, CSF3, CSF2, GSTT1, GZMA, DNAJA1, HLF, BST2, HOXA9, TLX1, UHRF1, IER3, ILIB, IL2, IL3, IL6, IL6R, IL10, IL15, IRF4, JAK1, JAK2, MKI67, XRCC5, LAG3, LCK, LEPR, LMO2, LIF, LRP, LSP1, LYL1, NFKB1, MAL, MAGEA1, MBP1, MCL1, MDM2, ABCB1, ABCB4, MEN1, CXCL9, MLF1, MLL, MMP9, NDUFB, MPO, ABCC3, MTCP1, MYOD1, MX1, NINJ1, NPM1, IL32, NUMA1, OGGI, CDKN2B, CDKN2A, CDKN2C, CDKN1A, CDKN1B, CDK5R1, TOPORS, P55CDC, CDKN1C, TP73, PAX5, PBX1, PBX3, ENPP1, PCA1, PCNA, PDGFRB, PRKCQ, PLK1, PML, PRAME, PRKCI, PTEN, PTGS1, PTHLH, SPI1, PTK2B, RAD51, RAG1, RARA, KRAS2, RBI, VEGF, CD28, RBBP4, DDX6, APEX, DPF2, RGS1, HMMR, STAT5B, BIRC5, TALI, NXF1, TCL1A, TRA@, TCRbeta, DNTT, TERT, ERBB4, ERBB2, EGFR, THPO, TIAM1, TK1, TNFRSF1A, TOP2A, PLS3, TRADD, TNFSF10, TRAP1, THBS1, SUMO1, UVRAG, VPREB1, WNT16, WT1, CCND3, CDK2, p14ARF, HELLS, GATA2, GATA1, MLLTIO, PICALM, KIT, IL3RA, CEBPA, ITGA6, TRAF3, DAPK1, MAP3K12, PRKDC, DNMT3B, GSTP1, HOXA10, ID2, GRK4, STAT1, TFRC, RPL37A, RPL41, HNRPL, ILF2, TAGLN2, CAPN2, PSMA5, PMM1, MLF2, PPP1CC, CASC3, KIAA0864, TXNRD1, PSMD7, EIF2B2, HLA-A, MCM7, TNFRSF25, LGALS3, HLA-DPA1, PLAU, ANK2, SERPINA9, NPM3, CCR6, HCK, GNL3, GRB2, BCL2A1, ELF1, CTSB, GCET2, FN1, PDCD1, CDKN3, CATSD, HSPB1, ACTN1, BMP6, FAM38A, CD48, IL4R, DRP2, JUNB, S100A8, ZNFNIA1, MERTK, KLF13, CEBPB, TFCP2, CREB1, NFIC, GABPB2, EGR1, KLF1, ETS1, ETS2, FLI1, GATA3, CBFA2T1, HIF1A, TCF1, HOXD8, HOXD9, MAFK, EDF1, ELF4, ZNF42, NF1, NFATC1, PAX6, PAX8, PLP, RORA, SP1, TBP, TCF7, ETV7 y ZAP70 empleando la composición de la reivindicación 6.