Un polipéptido glucosilado sustancialmente purificado, dicho polipéptido glucosilado comprende un eje polipéptido CD44 en el que dicho polipéptido glucosilado comprende glicanos fucosilados y modificados con ácido siálico y se une a selectina-E y selectina-L

Polipéptidos ligandos para selectina-E/selectina-L de la célula hematopoyética y métodos de utilización de los mismos.

Declaración como investigación subvencionada federalmente

Este invento se realizó con la ayuda del gobierno de los Estados Unidos con las becas NHLBIRO1 y CA84156 de los "National Institutes of Health". El gobierno tiene ciertos derechos en el invento.

Campo del invento

El invento proporciona un polipéptido glucosilado purificado sustancialmente, dicho polipéptido glucosilado incluye un polipéptido central CD44 e incluye glucanos que contienen Fucosa y Ácido Siálico, y se une a selectina-E y selectina-L.

Fundamento del invento

La citoarquitectura especializada del microambiente hematopoyético está creada por interacciones discretas de adherencia célula-célula y célula-matriz extracelular, que están estrechamente reguladas por la expresión de moléculas de adhesión específicas de línea. Las células progenitoras hematopoyéticas (CPHs) más inmaduras se caracterizan por la ausencia de marcadores específicos de línea y la expresión de la molécula de superficie CD34. Varias moléculas de adhesión se expresan en las CPHs, incluyendo CD44 (el "receptor del ácido hialurónico", también conocido como H-CAM), miembros de la superfamilia de las integrinas (v.g. LFA-1, VLA-4) y de las inmunoglobulinas (por ejemplo ICAM1), y un miembro de la familia de las selectinas, la selectina-L. La selectina-L (CD62L) es una proteína de unión a carbohidratos dependiente del calcio, miembro de una familia de moléculas de adhesión que también incluye la selectina-E (CD62E), expresada en el endotelio vascular activado, y la selectina-P (CD62P), que se encuentra tanto en las plaquetas activadas como en las células endoteliales. Las interacciones mediadas por las selectinas son críticas, no sólo para el reclutamiento rápido y eficaz de los leucocitos a los lugares de lesión, sino para la migración tejido-específica como se ilustra en: (1) "homing" de los linfocitos a los ganglios linfáticos periféricos, (2) tropismo cutáneo de las células T y (3) la entrada de la célula progenitora hematopoyética (CPH) en la médula ósea.

Resumen del invento

El invento caracteriza un nuevo polipéptido glucosilado expresado en células progenitoras hematopoyéticas humanas normales y en blastos leucémicos llamado ligando para selectina-E/selectina-L de la célula hematopoyética - "hematopietic cell E-selectin/L-selectin ligand (HCELL)". Los polipéptidos de HCELL se refieren aquí también como "CD44 KG1a". HCELL es una nueva forma glucosilada de CD44 que contiene N-glucanos fucosilados y modificados con ácido siálico que reaccionan con HECA-452. El polipéptido HCELL es un ligando tanto para selectina-L como para selectina-E.

También se describe aquí un método para identificar células madre haciendo que la población celular a estudio contacte con uno o más agentes que se unen específicamente a HCELL bajo unas condiciones suficientes para formar un complejo entre el agente y la célula madre. El complejo se detecta, y si está presente indica que la célula es una célula madre. Los agentes apropiados incluyen un anticuerpo anti-CD44 o un anticuerpo con una especificidad de unión como la del anticuerpo monoclonal HECA-452.

La célula madre también se puede identificar colocando un polipéptido selectina, por ejemplo, selectina-E o selectina-L inmobilizadas en una fase sólida y haciendo contactar esta fase sólida con una muestra de fluido que contenga en suspensión las células a analizar. La célula madre se identifica mediante la observación de las células que se adhieren a la fase sólida. La célula a identificar puede ser, por ejemplo, de sangre o de médula ósea.

También se describen aquí diversos métodos para aislar una célula madre (por ejemplo, una célula madre pluripotente) de una población de células. Una célula madre se aísla haciendo contactar una población de células con uno o más agentes que se unen específicamente al polipéptido HCELL bajo las condiciones suficientes para formar un complejo entre esos agentes y la célula madre. La formación del complejo se detecta y se extrae de la población de células, aislando de esta forma la célula madre de la población celular. Adicionalmente, el complejo célula madre/agente queda desunido.

Alternativamente, una célula madre es aislada mediante un polipéptido selectina, por ejemplo, selectina-E o selectina-L inmovilizada en una fase sólida y haciendo contactar esta fase sólida con una muestra fluida que contiene células en suspensión. La fase sólida entra en contacto con la muestra de fluido de manera que se alcance una presión de cizalla en la superficie de la fase sólida. Las células madre son aisladas recuperando las que están adheridas a la fase sólida.

También se describen métodos para tratar enfermedades del sistema hematopoyético, cáncer y otras enfermedades tributarias de ser tratadas con células madre (por ejemplo, terapia con células madre) en mamíferos, lo que incluye administrar al mamífero un compuesto que contenga las células aisladas de acuerdo con los métodos descritos arriba.

Además se describe un método para aumentar la afinidad de una célula por la selectina-E y/o selectina-L, por medio de hacer contactar la célula con uno o más agentes que aumenten la expresión o actividad del polipéptido HCELL en la superficie celular, y así aumentar la afinidad de la célula por la selectina-E y/o selectina-L. Los agentes apropiados incluyen por ejemplo, un ácido nucleico que codifique CD44, una glucosiltransferasa o un polipéptido glucosidasa.

También se describen métodos para aumentar el potencial de implante de una célula madre, tomando una célula madre y poniéndola en contacto con uno o más agentes que aumenten la expresión en la superficie celular o la actividad en la célula del polipéptido HCELL, y de esta forma aumentar el potencial de implante de la célula madre.

Alternativamente, el potencial de injerto de una población celular se aumenta proporcionando un polipéptido selectina, por ejemplo, selectina-E o selectina-L inmovilizados en una fase sólida y contactando la fase sólida con una muestra de fluido que contenga la población celular. La fase sólida entra en contacto con la muestra fluido de forma que se alcance una presión de cizalla en la fase sólida. Las células que se adhieren a la fase sólida se recuperan.

Los niveles de células madre implantadas en un sujeto se aumentan administrándole un agente que incremente la expresión del polipéptido HCELL.

Los agentes apropiados incluyen, por ejemplo, un ácido nucleico que codifique CD44, glucosiltransferasa o un polipéptido glucosidasa. Alternativamente, los niveles de células madre implantadas en un sujeto se aumentan administrando al sujeto un compuesto que contenga células aisladas de acuerdo a los métodos descritos arriba.

También se describen métodos para tratar trastornos hematopoyéticos, por ejemplo leucemia, en un sujeto. La enfermedad hematopoyética se trata administrando al sujeto un agente que disminuya la expresión de polipéptido HCELL en el sujeto. Alternativamente, el trastorno hematopoyético se trata tomando sangre del sujeto y poniéndola en contacto con uno o más agentes que se unan específicamente al polipéptido HCELL en las condiciones necesarias para formar un complejo entre los agentes y la célula sanguínea. El complejo se detecta, si está presente se retira de la sangre. La sangre es reintroducida en el sujeto.

Adicionalmente, un trastorno hematopoyético se trata colocando sangre del sujeto y un polipéptido selectina, por ejemplo selectina-E o selectina-L inmobilizados en una fase sólida y poniendo en contacto la fase sólida con la sangre. La fase sólida entra en contacto con la muestra de sangre alcanzando una presión de cizalla en la superficie de la fase sólida. La sangre es entonces reintroducida en el sujeto.

Además la enfermedad hematológica se puede tratar administrando al sujeto un agente que se una específicamente a la glucoproteína HCELL.

El invento también caracteriza el uso de una glucoproteína como se describe aquí en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno inflamatorio.

También se describe un método para diagnosticar o determinar la susceptibilidad de una persona a padecer un trastorno hematológico, poniendo en contacto una población de células derivada del sujeto con uno o más agentes que se unan específicamente a una glucoproteína...

1. Un polipéptido glucosilado sustancialmente purificado, dicho polipéptido glucosilado comprende un eje polipéptido CD44 en el que dicho polipéptido glucosilado comprende glicanos fucosilados y modificados con ácido siálico y se une a selectina-E y selectina-L.

2. El polipéptido glucosilado del documento 1, en el que dicho eje CD44 comprende la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 1.

3. El uso del polipéptido glucosilado del documento 1 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una alteración inflamatoria en dicho sujeto.

4. El polipéptido glucosilado del documento 1 para el uso en el tratamiento de una alteración inflamatoria.