Compuesto de fórmula

BODIPY aminoacetaldehído dietil acetal.

Ámbito técnico

La presente invención se refiere en general a las células madre, y en particular a un método de aislamiento de células madre y a reactivos adecuados para ser usados en tal método.

Antecedentes

Las células madre hematopoyéticas (HSC) más primitivas reconstituirán todos los linajes hematopoyéticos para toda una vida. Estas células madre hematopoyéticas pluripotentes (PHSC) son las células trasplantables que finalmente son las dianas para el aporte de genes en las terapias génicas basadas en las células madre. Una característica definitoria de las PHSC es la de que estas células sobrevivirán a la mayoría de los regímenes de acondicionamiento citoablativo. Los mecanismos de su resistencia a estos agentes tóxicos sugieren potenciales estrategias mediante las cuales estas células puedan ser seleccionadas in vitro. Un mecanismo de la resistencia a los fármacos radica en la capacidad de efluir las sustancias tóxicas fuera de la célula por medio de la bomba de multirresistencia a fármacos (MDR). Sustratos fluorescentes para la bomba de MDR han permitido el aislamiento de PHSC tomando como base su alta capacidad de eflujo de colorante en una variedad de sistemas de ensayo. Las resistencias a los fármacos pueden también ser conferidas por mecanismos más específicos. Por ejemplo, una aldehído deshidrogenasa (ALDH) citosólica media la resistencia a la ciclofosfamida (CPA), que es un agente alquilante que se usa en regímenes citorreductores en preparación para el trasplante de médula ósea. Así, la expresión de ALDH puede ser considerada como un marcador seleccionable para las auténticas PHSC.

La eficacia terapéutica de la CPA ha sido atribuida en gran medida a la capacidad de las PHSC y de las células de las criptas intestinales para sobrevivir al régimen farmacológico. Las progenitoras hematopoyéticas humanas expresan una ALDH citosólica, y HSC primitivas humanas derivadas de células madre de la sangre periférica movilizada pueden ser seleccionadas al ser puestas en cultivo con ciclofosfamida por espacio de 7 días. Jones et al. han demostrado que pueden aislarse PHSC murinas reconstitutivas a largo plazo previendo un sustrato fluorescente membrano-permeable para la ALDH y seleccionando entonces las células con los más altos niveles de actividad de ALDH (Jones, Blood 85:2742 (1995); Jones et al., Blood 88:487 (1996)). En estos estudios se usó dansilo aminoacetaldehído (DAAA) para colorear células de médula ósea murina preparadas mediante elutriación en contracorriente.

Los estudios preliminares realizados usando DAAA indican que este reactivo es inutilizable con preparaciones de células hematopoyéticas humanas porque la intensidad de señal del reactivo es demasiado alta como para resolver poblaciones celulares discretas por citometría de flujo. La presente invención aporta un sustrato fluorescente para ALDH que está exento de los problemas que van asociados al DAAA y que puede ser usado en la purificación de células hematopoyéticas primitivas humanas.

Breve exposición de la invención

La presente invención proporciona el compuesto de la reivindicación 1. En la presente invención se describe un nuevo reactivo y método para aislar células madre entre las que se incluyen las células madre humanas. El reactivo es un sustrato fluorescente para ALDH. El método comprende el paso de colorear una población celular que incluye células madre primitivas con el sustrato en presencia de un inhibidor de la actividad de MDR. La ALDH que está presente en las células convierte el sustrato en un producto que es atrapado dentro de las células. Puesto que las células madre primitivas tienen unos niveles de actividad de ALDH que son más altos que los de otros tipos de células, estas células se colorean con mayor luminosidad que otros tipos de células. La presencia del inhibidor de la MDR reduce el eflujo del sustrato desde las células madre.

Los objetos y ventajas de la presente invención quedarán claramente de manifiesto a la luz de la descripción siguiente.

Breve descripción de los dibujos

Figuras 1A-1D. La coloración con BAAA identifica las células con altos niveles de actividad de ALDH. La L1210/cpa es una derivada de la línea celular leucémica L1210 que sobreexpresa ALDH. (Las Figs. 1A y 1B representan células L1210, más DEAB y menos DEAB, respectivamente; y las Figs. 1C y 1D representan células L1210/cpa, más y menos DEAB, respectivamente).

Figuras 2A-2D. El BAAA es efluido por una bomba de MDR desde células hematopoyéticas, y en particular desde células CD34⁺ primitivas, como pone de manifiesto la diferencia entre las células CD34⁺ que tienen luminosidad de BODIPY (BODIPY^br) (Fig. 2B) en presencia y en ausencia de verapamilo como inhibidor de la MDR (las Figs. 2A y 2B son para t=0, menos y más verapamilo, respectivamente; y las Figs. 2C y 2D son para t=30', más y menos verapamilo, respectivamente).

Figuras 3A-3D. Células ALDH^br (es decir, células con propiedades de baja SSC (SSC = dispersión lateral de la luz) que se colorean con luminosidad con BAAA en presencia de un inhibidor de la MDR) están enriquecidas en células con el inmunofenotipo CD34⁺CD38^lo/- primitivo que va tradicionalmente asociado a las células madre primitivas.

Figuras 4A y 4B. La intensidad de coloración con BAAA está en correlación inversa con la expresión de CD38 (Fig. 4A) y de CD71 (Fig. 4B) en las células CD34⁺.

Figuras 5A-5C. Células ALDH^br están enriquecidas en progenitoras iniciales equivalentes a células CD34⁺ y están más enriquecidas en progenitoras muy primitivas que las células CD34⁺. (Fig. 5A = progenitoras (HPCA), Fig. 5B = progenitoras iniciales (a las 5 semanas de LTC (LTC = cultivo a largo plazo) y Fig. 5C = progenitoras primitivas (a las 8 semanas de LTC)).

Figura 6. Preparación de BAAA. Usando un vial de ámbar, una solución de aminoacetaldehído dietilacetal (0,019 mmoles, Aldrich Chemical Co.) en tetrahidrofurano seco (THF, 0,5 ml) fue añadida gota a gota a una solución de BODIPY FL, SE (0,013 mmoles, Molecular Probes) en THF seco (0,5 ml). Una vez concluida la adición, el vial fue tapado y la mezcla de reacción fue agitada por espacio de 30 min. El THF fue evaporado y el residuo fue disuelto en cloruro de metileno mínimo y fue luego cromatografiado en gel de sílice usando acetato de etilo-hexano (1:1) como eluyente. El producto, BODIPY-aminoacetaldehído dietilacetal, fue recuperado en rendimiento cuantitativo e identificado mediante NMR (NMR = resonancia magnética nuclear) protónica.

Descripción detallada de la invención

En la presente invención se describe un método de aislamiento de células madre y a un reactivo adecuado para ser usado en tal método. El método comprende poner a una población de células que comprende células madre en contacto con un sustrato detectable para aldehído deshidrogenasa (ALDH), siendo dicho sustrato convertido en un producto detectable por la ALDH, siendo ese producto retenido en las células. El sustrato es BODIPY-aminoacetaldehído (BAAA) y el eflujo de BAAA desde las células, y en particular desde las células madre que están presentes en la población, es inhibida por el concurrente uso de un inhibidor de la MDR.

Las fuentes de poblaciones celulares que son adecuadas para ser usadas incluyen la sangre del cordón umbilical, la médula ósea, la sangre periférica y el hígado fetal. Puede usarse cualquier población celular que incluya células madre, independientemente del origen tisular (como p. ej. el intestino, la piel, los músculos, los nervios, etc.). Si bien puede ser de esperar que el método sea aplicable a una variedad de poblaciones celulares de mamíferos no humanos, el mismo es particularmente útil para aislar células madre humanas de fuentes que incluyan las mencionadas anteriormente.

Los sustratos que son adecuados para ser usados incluyen sustratos para ALDH, y en particular sustratos específicos para ALDH que son detectables o llevan una etiqueta detectable y que son convertidos por la acción de la ALDH en productos que son detectables o llevan la etiqueta detectable, siendo dichos productos retenidos en las células, y en particular en las células madre. En una realización preferida, el sustrato es un sustrato fluorescente que tiene un perfil de emisión de fluorescencia discreta que es idéntico al del FITC (FITC = isotiocianato de fluoresceína). Dicho sustrato es el BAAA.

 

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Reivindicaciones:

1. Compuesto de fórmula

que es BODIPY aminoacetaldehído dietil acetal.

 

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