MEDIO DE CULTIVO CELULAR Y PROCEDIMIENTO DE CULTIVO DE CÉLULAS MADRE Y CÉLULAS PROGENITOR.

Utilización de un medio de cultivo celular que contiene menos de 500 mg/l de glucosa y menos de 500 µg/l de inositol,

que comprende un medio basal suministrado como una solución diluida, una solución concentrada o un polvo que contiene menos de 500 mg/l de glucosa y menos de 500 µg/l de inositol, respecto de la solución final diluida, para cultivar, amplificar, purificar y/o enriquecer células madre somáticas o células madre de línea germinal

La invención se refiere a la utilización de un medio de cultivo celular que permite una amplia expansión de las células madre somáticas, tales como las células madre hematopoyéticas y/o sus células progenitor tempranas y células madre de línea germinal, manteniendo al mismo tiempo su potencial regenerativo, y a un procedimiento para cultivar células madre y/o sus células progenitor tempranas. [0002] Campo Técnico. Las células madre son células primales que se encuentran en la mayoría de los organismos pluricelulares. Conservan la capacidad de renovarse a sí mismas mediante división celular mitótica y pueden diferenciarse en una gama muy diversa de tipos de células especializadas. Las tres amplias categorías de células madre de mamíferos son: células madre embrionarias, obtenidas a partir de los blastocitos; células madre de línea germinal, responsables de la generación de gametos; y células madre somáticas. El término célula madre somática o adulta se refiere a cualquier célula que no sea una célula embrionaria y una célula madre de línea germinal, y presenta dos propiedades: la capacidad de dividirse y crear otra célula igual que ella misma y dividirse para crear una célula más diferenciada que ella misma. El término célula madre somática se prefiere al de célula madre adulta, ya que las células pueden encontrarse durante el desarrollo y en los niños, así como en adultos. La mayoría de las células madre somáticas generan un número limitado de líneas (multipotentes) y puede hacerse referencia a las mismas por su tejido de origen (por ejemplo, células madre de la médula ósea). O por su potencial de diferenciación (célula madre hematopoyética, célula madre mesenquimal, célula madre endotelial, etc.). Las células

madre hematopoyéticas (HSC) son células madre somáticas que pueden aislarse a partir de la médula ósea o de la sangre, incluyendo la sangre del cordón umbilical. Las HSC son capaces de regenerar las HSC, y diferenciarse en todos los tipos de células sanguíneas, incluyendo las mieloides (monocitos y macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos,

progenitor hematopoyéticas se obtienen de las HSC y han perdido la capacidad de constituir una o más de estas líneas, pero aún no son maduras. El término “progenitor tempranas” se refiere a aquellas células obtenidas de forma más directa a partir de las HSC, que conservan la mayoría o la totalidad del potencial de diferenciación, pero que han perdido la capacidad de regenerar las HSC. En un entorno experimental, las HSC conservan la capacidad de regenerar indefinidamente un sistema hematopoyético funcional (actividad de repoblación a largo plazo), mientras que las progenitor tempranas tiene la capacidad de regenerar un sistema hematopoyético dañado durante unos pocos meses (por lo general 3) (actividad de repoblación a corto plazo). [0003] Para garantizar la auto-renovación, las células madre se someten a dos tipos de división celular. La división simétrica origina dos células hijas idénticas dotadas de propiedades de células madre. La división asimétrica, por otra parte, genera tan sólo una célula madre y una célula progenitor con un limitado potencial de auto-renovación. [0004] Las cepas celulares son células adaptadas a un cultivo celular, pero con un potencial de división finito. Una línea celular es un cultivo celular permanente que proliferará indefinidamente si se le facilita un medio y un

espacio apropiados. Las líneas celulares difieren de las cepas celulares en que han escapado al límite de Hayflick y

Las células madre hematopoyéticas contenidas en fracciones celulares aisladas de la médula ósea o de la sangre se han utilizado durante muchos años para generar un sistema sanguíneo e inmune funcional en pacientes cuyos propios sistemas han resultado dañados por la quimioterapia, una enfermedad o la exposición a radiación. No obstante, la baja frecuencia y la inactividad mitótica típicas de las células madre de tejidos sigue constituyendo una importante barrera para su análisis y aplicación clínica. Por ello, el número de células madre terapéuticas en la sangre de un solo cordón umbilical suele considerarse insuficiente para trasplantarlas a un paciente adulto, mientras que la modificación genética de células madre cultivadas, a efectos de terapia celular, está limitada tanto por su baja frecuencia como por su baja actividad mitótica, en comparación con la diferenciación de progenitor. Igualmente, el bajo número de células madre hematopoyéticas puede impedir que se intente generar material, bien para el trasplante repetido de HSCs o para su reprogramación en volúmenes terapéuticamente útiles de tejidos no hematopoyéticos. [0006] Estado de la técnica. Por estos motivos, ha habido muchos intentos de establecer unas condiciones de cultivo bajo las cuales las células madre hematopoyéticas puedan expandirse (Hofmeister et al., 2007). Estos incluyen cultivos efectuados en contacto directo con células de apoyo (estromales); la utilización de medios condicionados por células de apoyo; y el complemento de los medios con diversas

sustancias que favorezcan la supervivencia y la proliferación de células indiferenciadas. [0007] Los medios utilizados para el cultivo de células madre hematopoyéticas hasta la fecha se ha basado en la adaptación y complementación de medios basales estándar (incluyendo el medio basal de Tagle, el medio de Tagle modificado por Dulbecco, el medio de Dulbecco modificado por Iscove, el medio de Fischer y el medio de Glasgow), que contienen glucosa (por lo general, a unas concentraciones de entre 1 g/l y 4,5 g/l) e inositol (por lo general, en forma de mio-inositol, cis-1,2,3,5-trans-4,6-ciclohexanohexol, a concentraciones de entre 1 mg/l y 36 mg/ml). El medio mínimo esencial de Eagle (MEM) contiene 1 g/l de glucosa y 2 mg/l de Inositol. [0008] La glucosa es una de las principales fuentes de carbono y energía, y en general se asume que es necesaria para el cultivo de todas las células de mamíferos, a excepción de unos pocos tipos celulares que son capaces de sintetizar su propia glucosa mediante gluconeogénesis. Los medios denominados bajos en glucosa contienen generalmente 1 g/l de glucosa, mientras que los denominados de alto contenido en glucosa contienen 4,5 g/l de glucosa. El inositol es un constituyente esencial de una familia de moléculas (fosfatidilinositol y los fosfatos del inositol) que son necesarios para la comunicación de señales procedentes de diversos receptores de reguladores extracelulares de la supervivencia, la proliferación y la diferenciación celular. Aunque el inositol puede sintetizarse intracelularmente a partir de la glucosa, lo normal es incluir inositol en el medio. Las concentraciones solían variar ampliamente entre 0,05 mg/l y 36 mg/l. Un medio disponible comercialmente y explícitamente diseñado para el

cultivo de células hematopoyéticas y progenitor (Methostem, PAA Laboratories) contiene 4,5 g/l de glucosa y 7,2 mg/l de inositol como mio-inositol). [0009] El documento US 5747341 describe un medio de cultivo celular con baja osmolaridad para el establecimiento

corto período de escasez de glucosa en cultivos de células pancreáticas, a fin de comprobar la posterior respuesta a la glucosa. [0010] Stolzing y otros (Rejuvenation Research 9(1): 3135) describen la senescencia replicativa inducida por la glucosa en células madre mesenquimales. Se examinó el efecto de concentraciones de glucosa de entre 250 mg/l hasta 4500 mg/l. [0011] Deficiencias de las soluciones conocidas. En ninguna de las formulaciones de medios disponibles hasta la fecha ha sido posible conseguir una amplia expansión de las células madre hematopoyéticas (HCS) sin que disminuya su potencial regenerativo, asociándose estrechamente la división de las células madre en las condiciones del cultivo con la progresiva diferenciación (Wilson y Trumpp, 2006). [0012] El primer objetivo de la invención consiste en proporcionar un medio de cultivo celular que permita el cultivo y la expansión de las células madre somáticas o las células madre de línea germinal y su células progenitor tempranas, en especial las células madre hematopoyéticas...

1. Utilización de un medio de cultivo celular que contiene menos de 500 mg/l de glucosa y menos de 500 µg/l de inositol, que comprende un medio basal suministrado como una solución diluida, una solución concentrada o un polvo que contiene menos de 500 mg/l de glucosa y menos de 500 µg/l de inositol, respecto de la solución final diluida, para cultivar, amplificar, purificar y/o enriquecer células madre somáticas o células madre de línea germinal.

2. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el medio basal contiene menos de 100 mg/l de glucosa y menos de 100 µg/l de inositol, respecto de la solución final diluida.

3. Utilización de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el medio basal contiene menos de 10 mg/l de glucosa y menos de 10 µg/l de inositol, respecto de la solución final diluida.

4. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el medio basal contiene menos de 200 mg/l de L-glutamina y entre 10 mg/l y 500 mg/l de L-glutamato, respecto de la solución final diluida.

5. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el medio basal contiene entre 10 mg/l y 200 mg/l de L-serina y entre 5 mg/l y 100 mg/l de glicina y/o entre 5 mg/l y 100 mg/l de L-cisteína, respecto de la solución final diluida.

6. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el medio basal contiene adicionalmente entre 1 mg/l y 1 g/l de nucleósidos o precursores de nucleósidos, respecto de la solución final diluida.

7. Utilización de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el medio basal contiene entre 1 mg/l y 50 mg/l de cada compuesto elegido de adenosina, guanosina, citidina y uridina.

8. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el medio de cultivo celular se complementa bien mediante un suero o bien mediante un componente sustitutivo del suero.

9. Utilización de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el componente de sustitución del suero comprende albúmina, selenio, transferrina y ácidos grasos esenciales.

10. Utilización de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en la que el contenido de glucosa e inositol en el suero debe reducirse mediante diálisis y/o tratamiento enzimático.

11. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 8 a 10, en la que el medio de cultivo celular se complementa mediante factores de crecimiento que respaldan el desarrollo de células madre, otros activadores y/o inhibidores de vías de señalización celular.

12. Procedimiento de cultivo, amplificación, purificación y/o enriquecimiento de células madre somáticas o células madre de línea germinal en el que las células se cultivan in vitro en un medio de cultivo celular como el definido en una de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que las células se cultivan en una atmósfera que contiene entre el 0,1% y el 5% de O2.

14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en el que las células madre se enriquecen a partir de sangre y/o médula ósea.

15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la sangre y/o médula ósea se aíslan a partir de un paciente con cáncer o leucemia.