Un compuesto que inhibe la activación del complemento, que comprende un péptido que tiene una secuencia:

Xaa1 Cys - Val - Xaa2 - Gln - Asp - Trp - Gly - Xaa3 - His - Arg - Cys - Xaa4 (SEC ID Nº:15); en la que: Xaa1 es Ile, Val, Leu, Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu o un dipéptido que comprende Gly-Ile; Xaa2 es Trp o un análogo de Trp; Xaa3 es His, Ala, Phe o Trp; Xaa4 es Thr, Thr, Ile, Val, Gly, o un tripéptido que comprende Thr-Ala-Asn, en la que un -OH en carboxi terminal de cualquiera de L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly o Asn es opcionalmente sustituido por NH2; y los dos residuos de Cys están unidos por un puente disulfuro, en la que (a) el análogo de Trp en Xaa2 es un anillo aromático bicíclico sustituido o insustituido o dos o más anillos aromáticos monocíclicos sustituidos o insustituidos; o (b) el análogo de Trp en Xaa2 se selecciona del grupo que consiste en 2-naftilalanina, 1-naftilalanina, ácido carboxílico de 2-indanilglicina, dihidrotriptófano y benzoilfenilalanina; o (c) el análogo de Trp en Xaa2 es un indol, naftilo o dibenzoílo sustituido o insustituido; o (d) Xaa1 es Ac-Ile, Xaa2 es Trp o un análogo de Trp que es un indol, naftilo o dibenzoílo sustituido o insustituido, Xaa3 es Ala y Xaa4 es L-treonina o D-treonina

Análogos de compstatina con actividad mejorada Campo de la invención La presente invención se refiere a la activación de la cascada del complemento en el cuerpo. En particular, la presente invención proporciona péptidos y peptidomiméticos capaces de unirse a la proteína C3 e inhibir la activación del complemento.

Antecedentes de la invención El sistema del complemento es la primera línea de defensa inmunológica contra patógenos extraños. Su activación a través de la alternativa clásica o las vías de la lectina conduce a la generación de los péptidos anafilatóxicos C3a y C5a y a la formación del complejo de ataque de la membrana C5b-9. El componente del complemento C3 desempeña un papel central en la activación de las tres vías. La activación de C3 por las convertasas de la vía de C3 y su posterior fijación a la superficie diana conduce al ensamblaje del complejo de ataque de la membrana y, en última instancia, al daño o la lisis de las células diana. C3 es único en cuando a que posee una rica arquitectura que proporciona una multiplicidad de diversos sitios de unión a ligando que son importantes en la vigilancia inmunológica y las vías de respuesta inmunológica.

La activación inadecuada del complemento puede conducir a daños en la célula huésped. El complemento está implicado en varios estados de enfermedad, incluidas varias enfermedades autoinmunitarias, y se ha descubierto que contribuye a otros estados clínicos, tales como el síndrome respiratorio adulto, ataque cardíaco, rechazo tras xenotransplante y lesiones por quemaduras. También se ha descubierto que las lesiones tisulares mediadas por el complemento son el resultado de situaciones de bioincompatibilidad tales como las que se encuentran en los pacientes sometidos a diálisis o a derivación cardiopulmonar.

Las lesiones tisulares en las que participa el complemento están directamente mediadas por el complejo de ataque de la membrana e, indirectamente, por la generación de C3a y C5a. Estos péptidos inducen daños a través de sus efectos sobre los neutrófilos y los mastocitos. In vivo, las proteínas plasmáticas y de membrana proporcionan la regulación del complemento en las etapas de activación de C3 y C5. Los inhibidores de las proteínas plasmáticas son el factor H y la proteína de unión a C4, y las proteínas de membrana reguladoras localizadas sobre las superficies celulares son los receptores del complemento 1 (CR1) , el factor de aceleración del deterioro (DAF) y la proteína cofactor de membrana (MCP) . Estas proteínas inhiben las convertasas C3 y C5 (proteasas de múltiples subunidades) estimulando la disociación de los complejos de múltiples subunidades y/o inactivando los complejos mediante proteólisis (catalizada por el factor I) . Mediante ensato in vitro se han identificado varios agentes farmacológicos que regulan o modulan la actividad del complemento, pero in vivo se ha demostrado que la mayoría tiene una actividad baja o tóxica.

Hasta la fecha en la clínica no se usan inhibidores de la activación del complemento, aunque existen ciertos candidatos para uso clínico, específicamente una forma recombinante del receptor del complemento 1 conocido como el receptor soluble del complemento 1 (sCR1) y un anticuerpo monoclonal humanizado antiC5 (5G1.1-scFv) . Se ha demostrado que ambas sustancias suprimen la activación del complemento en modelos animales in vivo (Kalli y col., Springer Semin. Immunopathol. 15: 417-431, 1994; Wang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8563-8568, 1996) . No obstante, cada sustancia posee la desventaja de ser proteínas de peso molecular grande (240 kDa y 26.000 kDa, respectivamente) que son difíciles de fabricar y deben administrarse mediante infusión. De acuerdo con esto, recientes investigaciones han destacado el desarrollo de agentes activos más pequeños que son más fáciles de liberar, más estables y menos costosos de fabricar.

La patente de EE.UU. nº 6.319.897 concedida a Lambris y col. describe el uso de una biblioteca aleatoria combinatoria de péptidos presentados en fagos para identificar un péptido de 27 residuos que se une a C3 e inhibe la activación del complemento. Este péptido se fragmentó en un segmento cíclico de 13 residuos que mantenía una actividad completa, que en la técnica se denomina compstatina. La compstatina inhibe la escisión de C3 en C3a y de C3b por la C3 convertasa. La compstatina se ha investigado en una serie de experimentos de interfaz in vitro, in vivo, ex vivo e in vivo/ex vivo y se ha demostrado que: (1) inhibe la activación del complemento en suero humano (Sahu y col., J. Immunol. 157: 884-891, 1996) ; (2) inhibe la activación del complemento inducida por heparina/protamina sin efectos secundarios significativos (Soulika y col., Clin.Immunol. 96: 212-221, 2000) ; (3) prolonga la vida de un xenoinjerto porcino a humano perfundido con sangre humana (Fiane y col., Transplant.Proc. 31:934-935, 1999a; Fiane y col., Xenotransplantation 6: 52-65, 1999b; Fiane y col., Transplant.Proc. 32: 899-900, 2000) ; (4) inhibe la activación del complemento en modelos de derivación cardiopulmonar, plasmaféresis y circuitos extracorpóreos para diálisis (Nilsson y col., Blood 92: 1661-1667, 1998) ; y (5) posee toxicidad baja (Furlong y col., Immunopharmacology 48: 199-212, 2000) .

La compstatina es un péptido que comprende la secuencia ICVVQDWGHHRCT-NH2 (SEC ID Nº 1) , en la que Cys2 y Cys12 forman un puente disulfuro. Su estructura tridimensional se determinó usando espectroscopia RMN bidimensional homonuclear en combinación con dos metodologías computacionales restringidas experimentalmente. La primera metodología implicaba geometría de distancia, dinámica molecular e hibridación simulada (Morikis y col., Protein Science 7: 619-627, 1998) y la segunda metodología implicaba la optimización global (Klepeis y col., J. Computational Chemistr y , 20: 1344-1370, 1999) . La estructura de la compstatina reveló una superficie molecular que comprende un parche polar y un parche no polar. La parte polar incluye un giro β de tipo I y el parche no polar incluye el puente disulfuro. Además, se sintetizó una serie de análogos con sustituciones de alanina (un barrido de alanina) y se investigó la actividad, lo que reveló que los cuatro residuos del giro β y el puente disulfuro con el clúster hidrófobo adyacente son esenciales para la actividad inhibidora (Morikis y col., 1998, ant.) .

Usando un ensayo de actividad del complemento que comprende medir la lisis de eritrocitos mediada por una vía alternativa, se ha medido la CI50 de la compstatina en 12 μM. Ciertos de los análogos analizados anteriormente han mostrado actividad equivalente a la de la compstatina o ligeramente mayor. El desarrollo de los análogos o miméticos de la compstatina con mayor actividad constituiría un avance significativo en la técnica.

Sumario de la invención La presente invención proporciona análogos y miméticos del péptido inhibidor del complemento, compstatina (ICVVQDWGHHRCT-NH2; SEC ID Nº 1) , que tienen una actividad inhibidora del complemento mejorada en comparación con la compstatina.

En un aspecto, la invención caracteriza un compuesto que inhibe la activación del complemento, que comprende un péptido que tiene una secuencia:

Xaa1 Cys - Val - Xaa2 - Gln - Asp - Trp - Gly - Xaa3 - His - Arg - Cys - Xaa4 (SEC ID Nº:15) ; en la que:

Xaa1 es Ile, Val, Leu, Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu o un dipéptido que comprende Gly-Ile; Xaa2 es Trp o un análogo de Trp; Xaa3 es His, Ala, Phe o Trp; Xaa4 es L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, o un tripéptido que comprende Thr-Ala-Asn, en la que un -OH en carboxi terminal de cualquiera de L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly o Asn es opcionalmente sustituido por NH2; y los dos residuos de Cys están unidos por un puente disulfuro, en la que

(a) el análogo de Trp en Xaa2 es un anillo aromático bicíclico sustituido o insustituido o dos o más anillos aromáticos monocíclicos sustituidos o insustituidos; o

(b) el análogo de Trp en Xaa2 se selecciona del grupo que consiste en 2-naftilalanina, 1-naftilalanina, ácido carboxílico de 2-indanilglicina, dihidrotriptófano y benzoilfenilalanina; o

(c) el análogo de Trp en Xaa2 es un indol, naftilo o dibenzoílo sustituido o insustituido; o

(d) Xaa1 es Ac-Ile, Xaa2 es Trp o un análogo de Trp que es un indol, naftilo o dibenzoílo sustituido o insustituido, Xaa3 es Ala y Xaa4 es L-treonina o D-treonina.

En ciertas realizaciones, Xaa1 está acetilado y normalmente es Ac-Ile. En otra realización, Xaa3 es Ala. En ciertas realizaciones, Xaa2 es un análogo de Trp que comprende un componente de... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto que inhibe la activación del complemento, que comprende un péptido que tiene una secuencia:

Xaa1 Cys - Val - Xaa2 - Gln - Asp - Trp - Gly - Xaa3 - His - Arg - Cys - Xaa4 (SEC ID Nº:15) ; en la que:

Xaa1 es Ile, Val, Leu, Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu o un dipéptido que comprende Gly-Ile;

Xaa2 es Trp o un análogo de Trp; Xaa3 es His, Ala, Phe o Trp; Xaa4 es Thr, Thr, Ile, Val, Gly, o un tripéptido que comprende Thr-Ala-Asn, en la que un -OH en carboxi terminal de cualquiera de L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly o Asn es opcionalmente sustituido por NH2; y los dos residuos de Cys están unidos por un puente disulfuro, en la que (a) el análogo de Trp en Xaa2 es un anillo aromático bicíclico sustituido o insustituido o dos o más anillos aromáticos monocíclicos sustituidos o insustituidos; o

(b) el análogo de Trp en Xaa2 se selecciona del grupo que consiste en 2-naftilalanina, 1-naftilalanina, ácido carboxílico de 2-indanilglicina, dihidrotriptófano y benzoilfenilalanina; o

(c) el análogo de Trp en Xaa2 es un indol, naftilo o dibenzoílo sustituido o insustituido; o

(d) Xaa1 es Ac-Ile, Xaa2 es Trp o un análogo de Trp que es un indol, naftilo o dibenzoílo sustituido o insustituido, Xaa3 es Ala y Xaa4 es L-treonina o D-treonina.

2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que Xaa1 es Ac-Ile.

3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que Xaa3 es Ala.

4. El compuesto de la reivindicación 1 que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 4,

20 SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, SEC ID Nº 10, SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12 y SEC ID Nº 13.

5. El compuesto de la reivindicación 1 (a) , 1 (b) o 1 (c) , en el que Xaa1 es un dipéptido Gly-Ile, y Xaa 4 es un tripéptido Thr-Ala-Asn.

6. El compuesto de la reivindicación 5, que comprende un péptido que tiene la SEC ID Nº 14.

7. Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica uno o más péptidos que inhiba la activación del complemento, en el que el péptido comprende una secuencia:

Xaa1 Cys - Val - Xaa2 - Gln - Asp - Trp - Gly - Xaa3 - His - Arg - Cys - Xaa4 (SEC ID Nº:15) ; en la que:

Xaa1 es Ile, Val, Leu o un dipéptido que comprende Gly-Ile; Xaa2 es Trp; 30 Xaa3 es His, Ala, Phe o Trp; y Xaa1 es L-Thr, Ile, Val, Gly o un tripéptido que comprende Thr-Ala-Asn;

en la que los dos residuos de Cys están unidos por un puente disulfuro.

8. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 7, que codifica un péptido en el que Xaa3 es Ala.

9. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 8, que codifica un péptido que comprende la SEC ID Nº 35 14.

10. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 9, que codifica un concatémero de dos o más de un péptido que comprende la SEC ID Nº 14, en el que el concatémero codificado puede ser escindido por hidrazina para formar una multiplicidad de péptidos que comprenden la SEC ID Nº 14.

11. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 7.

12. Una célula que comprende el vector de expresión de la reivindicación 11.

13. La célula de la reivindicación 12, que es una célula bacteriana, fúngica, vegetal, de insecto o de mamífero.