METODO PARA LA PRODUCCION DE UNA TRANSCRIPTASA INVERSA AMV HETERODIMERICA ACTIVA, EN CELULAS PROCARIOTAS.

Método para la producción de una AMV-RT heterodimérica activa en células procariotas,

en el que

(i) se clonan una o varias secuencias de ADN que codifican las cadenas a y/o ß de la AMV-RT en plásmidos de expresión,

(ii) los plásmidos de expresión se transforman en células procariotas,

(iii) se induce la expresión soluble de la AMV-RT heterodimérica, y

(iv) se aísla la AMV-RT heterodimérica recombinante de las células, en el que la expresión se produce a una temperatura de crecimiento de aproximadamente 15ºC y a una concentración de inductor entre 0,1 M y 0,5 M

Método para la producción de una transcriptasa inversa AMV heterodimérica activa, en células procariotas.

La presente invención se refiere a un método para la producción de una transcriptasa inversa AMV (AMV-RT) activa, heterodimérica recombinante mediante la expresión de una o varias secuencias de ADN que codifican las subunidades a y/o ß de la AMV-RT en células procariotas bajo ciertas condiciones de crecimiento e inducción.

El descubrimiento de estas transcriptasas inversas en los años setenta demostró que era falso el "dogma central" de la biología molecular sobre la transferencia de información desde el ADN a través del ARN a las proteínas como un proceso unidireccional (Termin H. y Mizutani S., 1970 Nature 226:1211-1213; Baltimore D., 1970, Nature 226:1209-1211). La caracterización enzimática de estas polimerasas de ADN dependientes de ARN es la base para la comprensión actual del ciclo de amplificación de los virus ARN y de este modo también del desarrollo y extensión de enfermedades provocadas por este tipo de virus (cáncer, SIDA, etc.).

Sin embargo, las transcriptasas inversas también son una herramienta para los biólogos moleculares para la síntesis, amplificación y clonación de ADNs complementarios (RT-PCR). Esta tecnología permite un examen simplificado y acelerado de la expresión génica en células eucariotas. Tras aislar el ARNm total a partir de extractos celulares o tejidos, el ARNm se traduce de nuevo en ADNc mediante la transcriptasa inversa y se amplifica mediante la etapa subsiguiente de PCR para permitir la clonación y caracterización. En consecuencia, no es necesario, por un lado, elucidar las estructuras de intrones y exones de los genes, pero, por otro lado, también es posible examinar la expresión génica en la célula durante varios ciclos vitales o durante el desarrollo de enfermedades (tales como el cáncer).

Hasta ahora se han analizado en profundidad las transcriptasas inversas (RT) de tres retrovirus diferentes: La RT del Virus de la Leucemia Murina de Moloney (M-MLV). Este enzima está formado por una única subunidad con un peso molecular de 78 kDa (Prasad V.R., 1993 revisado en: Reverse Transcriptase ("Transcriptasas inversas"), Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 135). Además se conoce una RT del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV). Esta RT es un heterodímero compuesto por dos subunidades, p66 y p51, formándose la subunidad p51 por la escisión proteolítica de p66 (Le Grice S.F.J., 1993 revisado en: Reverse Transcriptase ("Transcriptasas inversas"), Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 163). Además se conocen RTs del Virus del Sarcoma-Leucosis Aviar (ASLV). La RT obtenible del Virus de la Mieloblastosis Aviar (AMV) también pertenece a la familia ASLV. Esta RT también es un heterodímero compuesto de una cadena-a con un peso molecular de aproximadamente 63 kDa y una cadena-ß con un peso molecular de aproximadamente 95 kDa. En este caso, la cadena-a también se forma por el procesamiento proteolítico de la cadena-ß (Golomb M. y Grandgenett D., 1979, J. Biol. Chem. 254: 1606-1613; Weiss R. y otros, eds. 1984, Molecular Biology of tumor viruses ("Biología molecular de los virus tumorales"), 2ª edición: RNA tumor viruses ("Virus tumorales ARN") 1/texto. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Mientras que la RT de M-MLV se expresa en E. coli en forma de monómero y la RT de HIV como un heterodímero, no ha sido posible hasta la fecha expresar de forma satisfactoria la AMV-RT como un heterodímero soluble o activo en E. coli u otros procariotas. Aunque según la patente WO 00/42199 se expresan algunas variantes de la RT en E. coli o preferentemente en células eucariotas de insecto, la RT deseada que se obtiene mediante este proceso está formada principalmente (aproximadamente un 90%) por un componente insoluble.

Además es difícil medir la AMV-RT en extractos celulares crudos de E. coli dado, por un lado, que los moldes de ARN se degradan por ARNasas intrínsecas de E. coli y, por otro lado, las cepas de E. coli poseen una polimerasa de ADN que también posee actividad RT además de la actividad polimerasa de ADN (Ricchetti, M. y Huc, H., 1993 EMBO J. 12 (2), 387-396). Por tanto esta actividad RT intrínseca de E. coli interfiere de forma considerable con la determinación de la actividad de la AMV-RT recombinante en extractos crudos de E. coli y en las fracciones de la purificación.

Por ello, el objetivo de la presente invención es dar a conocer una AMV-RT heterodimérica activa recombinante en cantidades adecuadas.

El objetivo se consigue mediante un método para la producción de una AMV-RT heterodimérica activa en células huésped procariotas en el que se clonan una o varias secuencias de ADN que codifican las subunidades o cadenas a y ß de la AMV-RT en plásmidos de expresión, se transforman los plásmidos de expresión en células procariotas, se induce la expresión de la AMV-RT heterodimérica con una concentración de inductor entre 0,1 y 0,5 mM a una temperatura de crecimiento de aproximadamente 15ºC, y se purifica la AMV-RT heterodimérica recombinante, es decir se aísla de las células. Son genes y secuencias de ADN adecuadas, entre otras, aquellas que codifican solamente una de las subunidades de la AMV-RT. A continuación puede convertirse una parte del producto de expresión mediante algunos procedimientos, tales como la escisión proteolítica de la cadena ß dando lugar a la otra subunidad. Las secuencias con identificador de secuencia nº4 y nº5 han demostrado ser particularmente adecuadas para el método de acuerdo con la invención que genera una AMV-RT heterodimérica activa compuesta por las subunidades con los identificadores de secuencia nº 6 y nº 7.

Los genes estructurales y las secuencias de ADN que codifican las subunidades de la AMV-RT pueden clonarse o bien en plásmidos de expresión independientes y diferentes o bien en un solo plásmido de expresión, opcionalmente en presencia de los denominados plásmidos colaboradores, y expresarse en una célula huésped adecuada. Son plásmidos de expresión adecuados, por ejemplo, pDS, pKK177-3 o pKKT5. De acuerdo con la presente invención, es preferente el plásmido pKKT5 en el cual se insertan los correspondientes genes estructurales bajo el control del promotor T5. Otros promotores potenciales, que son preferentemente promotores inducibles por IPTG, son, por ejemplo, los promotores lac, lac UV5 o tac. Plásmidos colaboradores alternativos, tales como el plásmido pUBS520 y marcadores de selección como la ampicilina o la kanamicina son en principio conocidos por los expertos en la técnica.

Los plásmidos de expresión y opcionalmente otros plásmidos colaboradores se transforman en una célula procariota huésped adecuada. De acuerdo con la presente invención es preferente la utilización de una cepa de E. coli tal como E. coli K12 C600, DH5a, LE392, JM83, JM105, NM522, M15, RR1?15, UT5600, TG1, A1200 o las cepas de E. coli B, BL21, HB101. De acuerdo con la presente invención es particularmente preferente la cepa de E. coli LE392.

La expresión de la AMV-RT heterodimérica puede inducirse mediante diversos procedimientos. En particular ciertas condiciones de crecimiento e inducción tienen efectos positivos sobre la expresión de la AMV-RT activa. Una temperatura de crecimiento de aproximadamente 15ºC y una concentración de inductor entre 0,1 mM y 0,5 mM, preferentemente de aproximadamente 0,15 mM, han demostrado ser particularmente adecuadas. De acuerdo con la presente invención se utilizan preferentemente como inductores IPTG (isopropilo-ß-D-tiogalactopiranósido) o lactosa.

Además se ha evidenciado que la expresión soluble de la AMV-RT en células procariotas puede aumentarse mediante la expresión concomitante de genes colaboradores. En particular, son genes colaboradores potenciales el gen trpT que codifica el ARNt del triptófano. Además son adecuados para la expresión soluble los genes de chaperonas tales como los genes que codifican GroEL y GroES, GrpE, ClpB, Dnak y DnaJ. Los genes de una o varias chaperonas se ubican en un plásmido colaborador con un promotor inducible; los genes que codifican las chaperonas GroEL y GroES se encuentran bajo el control de un promotor constitucional en el plásmido de expresión en el que también se ubican los genes estructurales de las cadenas a y/o ß. Sin embargo, es particularmente preferente, de acuerdo con la presente invención, que los genes que codifican GroEL y GroES se clonen en el...

1. Método para la producción de una AMV-RT heterodimérica activa en células procariotas, en el que

(i) se clonan una o varias secuencias de ADN que codifican las cadenas a y/o ß de la AMV-RT en plásmidos de expresión,

(ii) los plásmidos de expresión se transforman en células procariotas,

(iii) se induce la expresión soluble de la AMV-RT heterodimérica, y

(iv) se aísla la AMV-RT heterodimérica recombinante de las células, en el que la expresión se produce a una temperatura de crecimiento de aproximadamente 15ºC y a una concentración de inductor entre 0,1 M y 0,5 M.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que las secuencias de ADN que codifican las cadenas a y ß se expresan en plásmidos de expresión independientes en una célula.

3. Método, según la reivindicación 1, en el que las secuencias de ADN que codifican las cadenas a y ß se expresan en un plásmido de expresión en una célula.

4. Método, según las reivindicaciones 1 a 3, en el que tanto la cadena a como la ß se fusionan con una secuencia de péptido.

5. Método, según la reivindicación 4, en el que la cadena a o la cadena ß se fusionan con una secuencia de péptido compuesta por entre 2 y 10 residuos arginina y la cadena ß o la cadena a se fusionan con una secuencia de péptido compuesta por entre 2 y 10 residuos histidina.

6. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las secuencias de ADN que codifican las cadenas a y ß que están unidas a secuencias de ADN que codifican secuencias de péptido que son capaces de unión reversible, se expresan en un plásmido de expresión en una célula.

7. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las cadenas a y ß se fusionan con la misma secuencia de péptido capaz de unión reversible.

8. Método, según la reivindicación 7, en el que las cadenas a y ß están cada una de ellas fusionadas con una secuencia de péptido compuesta por entre 2 y 10 residuos histidina.

9. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la expresión se incrementa mediante la expresión concomitante de genes colaboradores.

10. Método, según la reivindicación 9, en el que se utiliza como gen colaborador el gen trpT que codifica el ARNt del triptófano.

11. Método, según la reivindicación 9, en el que la expresión se incrementa mediante la expresión concomitante de genes chaperona.

12. Método, según las reivindicaciones 9 u 11, en el que se expresan de forma concomitante los genes de GroEL y GroES, Dnak y DnaJ, GrpE y/o ClpB.

13. Método, según las reivindicaciones 11 o 12, en el que se clonan los genes GroEL y GroES en el plásmido de expresión que también porta los genes de las cadenas a y ß y en el que los genes de Dnak, DnaJ, GrpE y ClpB se clonan en un plásmido colaborador.

14. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que se utilizan materiales de cromatografía de afinidad adecuados para aislar o purificar la AMV-RT heterodimérica recombinante.

15. Método, según la reivindicación 14, en el que los materiales de cromatografía de afinidad utilizados para la purificación se unen de forma reversible a las diferentes secuencias de péptido unidas a las cadenas a y/o ß.

16. Método, según las reivindicaciones 14 o 15, en el que los materiales de cromatografía de afinidad utilizados para la purificación son materiales quelantes de iones de metal o intercambiadores de cationes.

17. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que la secuencia de ADN con el identificador de secuencia nº 5 o las secuencias de ADN con los identificadores de secuencia nº 4 y nº 5 se expresan en una célula huésped procariota.

18. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que se utiliza E. coli como célula huésped.

19. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que la AMV-RT heterodimérica activa está compuesta por las subunidades con los identificadores de secuencia nº 6 y nº 7.