Método para la medición de un metabolito de la vitamina D en una muestra,

comprendiendo el método las etapas siguientes:

a) tratar dicha muestra con un reactivo liberador bajo condiciones apropiadas para liberar el metabolito de la vitamina D respecto de la proteína ligante de vitamina D y no provocar la precipitación de proteínas,

b) someter la muestra tratada que se ha obtenido en la etapa (a) a cromatografía líquida, y

c) medir el metabolito de la vitamina D durante o después de la cromatografía líquida,

en el que dicho reactivo liberador se basa en una sal que presenta un N-heterociclo cuaternario a modo de catión

Medición mejorada de la vitamina D.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un método para medir un metabolito de la vitamina D en una muestra, comprendiendo el método las etapas siguientes: (a) tratar dicha muestra con un reactivo liberador de metabolito de la vitamina D bajo condiciones apropiadas para la liberación de un metabolito de la vitamina D a partir de vitamina D-proteína ligante y sin provocar la precipitación de las proteínas, (b) someter la muestra tratada que se ha obtenido en la etapa (a) a una separación cromatográfica, y (c) medir un metabolito de la vitamina D durante o después de dicha separación cromatográfica. La presente invención también se refiere a métodos para determinar el estatus de vitamina D en un sujeto y para la utilización en el diagnóstico de una enfermedad, y a agentes y kits para la utilización en la puesta en práctica de los métodos de la invención.

Tal como indica el término vitamina, es crucial una ingestión suficiente de vitamina D. El nivel de vitamina D o de metabolitos de vitamina D circulantes en un sujeto se denomina estatus de vitamina D. La mala nutrición con respecto a la vitamina D es un factor importante en el origen de algunas enfermedades, entre ellas el raquitismo infantil y la osteomalacia, e incluso la osteoporosis en adultos. El conocimiento del estatus de vitamina D mediante la medición de la vitamina D y de los metabolitos de la misma en una muestra clínica resulta muy útil en la evaluación de un paciente y pueden ayudar al médico clínico a establecer un diagnóstico. De esta manera, no es inesperado que se haya producido un incremento constante de los esfuerzos para mejorar los métodos de medición de la vitamina D y metabolitos de la misma en los líquidos corporales.

En la nutrición humana, la vitamina D se encuentra disponible en dos formas: como vitamina D₂ o como vitamina D₃. La vitamina D₂ se produce en el exterior del cuerpo mediante la irradiación del ergosterol procedente de levaduras y hongos, y se encuentra en el ser humano en el caso de que se ingiera en forma de alimentos enriquecidos o de preparaciones farmacéuticas. La vitamina D₃, por otra parte, se forma en animales a partir del 7-deshidrocolesterol bajo exposición a luz ultravioleta. Esta reacción se produce en la piel. La vitamina D₃ también se encuentra disponible en la dieta, por ejemplo en aceites de hígado de pescado.

La vitamina D nutricional, en forma de vitamina D₂ o D₃, tras su incorporación en el cuerpo humano resulta rápidamente convertida en el metabolito circulante, la 25-hidroxivitamina D, que se encuentra, en el exterior de las células, fuertemente unida a proteína en circulación ligante de vitamina D.

Debido a la rápida conversión de la vitamina D en su primer metabolito, la 25-hidroxivitamina D, la medición de la vitamina D no proporciona una indicación útil del estatus de vitamina D en un sujeto. Otros metabolitos de la vitamina D, tales como la 1a,25-dihidroxivitamina D, circulan a una concentración 1.000 veces inferior a la de los metabolitos 1a-hidroxilados, tales como la 25-hidroxivitamina D, y por lo tanto no contribuyen significativamente a la estimulación del metabolito de vitamina D total circulante. Por ello, los metabolitos la-hidroxilados no proporcionan una indicación directa o útil del estatus de vitamina D. La 25-hidroxivitamina D es el metabolito con la concentración sérica más alta y resulta fácil de medir. Por lo tanto, se ha convertido en el marcador más común del estatus de vitamina D en un sujeto.

Los metabolitos de la vitamina D también se unen a otras proteínas séricas, por ejemplo a la albúmina, aunque mucho menos estrechamente que a la proteína ligante. Se acepta generalmente que los métodos que facilitan la liberación de la vitamina D de un complejo de vitamina D-proteína ligante de vitamina D también resultarán apropiados para liberarlo de otros complejos menos fuertes. De esta manera, la rápida y fuerte unión de diversos metabolitos de la vitamina D a la proteína ligante de vitamina D es el problema principal durante la detección de un metabolito de la vitamina D y dificulta enormemente la medición. Todos los métodos conocidos actualmente requieren que los metabolitos de la vitamina D se liberen de la proteína ligante de vitamina D. En estos procedimientos, la proteína ligante de vitamina D habitualmente se desnaturaliza. Esto típicamente requiere también una etapa de extracción que separa la proteína ligante de vitamina D conjuntamente con otras proteínas desnaturalizadas respecto del metabolito de interés de la vitamina D y elimina la fracción de proteína desnaturalizada de la muestra. De esta manera, los metabolitos de interés de la vitamina D se encuentran disponibles en una fracción separada y resultan más fáciles de manipular y detectar.

La extracción se ha llevado a cabo mediante varios métodos, incluyendo la extracción basada en un solvente mediante la adición a la muestra de un solvente orgánico, tal como cloroformo, hexano o acetato de etilo y hexano. Las capas orgánicas y acuosas se separan y el solvente se evapora. A continuación, el residuo se reconstituye en un solvente miscible en agua, tal como etanol. También se han utilizado métodos de extracción con cartucho de fase inversa. Entre otros métodos tradicionales se incluyen la utilización de HPLC y la espectroscopía de masas para conseguir la separación de metabolitos individuales de la vitamina D y excluir de la muestra factores interfirientes, tales como proteínas ligantes.

Armbruster F.P. et al. (patente WO nº 99/67211) enseñan que una muestra de suero o de plasma puede tratarse con etanol con el fin de liberar un metabolito de la vitamina D respecto del complejo de éste y proteína ligante de vitamina D. La proteína precipitada se peletiza y se obtiene un metabolito de vitamina D en el sobrenadante. El metabolito de vitamina D comprendido en dicho sobrenadante puede detectarse fácilmente, por ejemplo mediante cualquier método basado en cromatografía líquida.

Se propone una solución alternativa en la patente EP nº 0 753 743. Se recomiendan las sales peryodato para conseguir la liberación de un metabolito de vitamina D respecto de la proteína ligante de vitamina D. De manera rutinaria, el precipitado que comprende la proteína ligante de vitamina D se separa mediante centrifugación y el sobrenadante se utiliza para la detección de un metabolito de interés de la vitamina D.

Vogeser M. et al., Clin. Chem. 50:1415-1417, 2004, han proporcionado recientemente el documento Candidate reference method for the quantification of circulating 25-hydroxyvitamin D₃ by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (Método candidato de referencia para la cuantificación de 25-hidroxivitamina D₃ circulante mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem). Para la cuantificación exacta se propone la utilización de 25-hidroxivitamina D₃ marcada con un isótopo estable. El estándar interno marcado isotópicamente se copurifica con la 25-hidroxivitamina D₃ natural y mediante la determinación de dicho estándar interno resulta posible compensar las variaciones en el procedimiento de extracción y/o de detección. Al igual que la mayoría de procedimientos rutinarios utilizados para medir un metabolito de la vitamina D, el método descrito por Vogeser et al. se basa en una etapa de extracción con acetonitrilo.

Bouillon R. et al. , Clin. Chem. 30:1731-1736, 1984, describen dos ensayos directos para 25-hidroxivitamina D. Aunque los ensayos descritos no requieren una etapa cromatográfica, tal como resulta necesario en métodos más tradicionales, todavía requieren la extracción de la vitamina D de las proteínas ligantes de vitamina D mediante la utilización de precipitación con solvente.

Holick M.F. y Ray R. (patente US nº 5.981.779) describen métodos para el ensayo de la vitamina D y metabolitos de la misma. Su procedimiento se basa en un ensayo de unión competitiva utilizando una proteína ligante purificada de vitamina D como el agente de unión específica. Un requisito para este ensayo también es que debe aislarse en primer lugar un metabolito de interés de la vitamina D de la muestra, separarse de su proteína ligante y únicamente entonces puede realizarse la medición.

Durante la medición de determinadas hormonas esteroides de suero, plasma u otros líquidos biológicos, se utilizan análogos esteroides para desplazar...

1. Método para la medición de un metabolito de la vitamina D en una muestra, comprendiendo el método las etapas siguientes:

en el que dicho reactivo liberador se basa en una sal que presenta un N-heterociclo cuaternario a modo de catión.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha cromatografía líquida es una cromatografía de columna que se lleva a cabo mediante la utilización de una columna que comprende una frita y un material de lecho.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha frita presenta un tamaño de poro de 0,2 ó 0,5 µm.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho material de lecho es particulado y las partículas presentan un diámetro de entre 1 y 10 µm.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha cromatografía líquida es cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).

6. Método según la reivindicación 1, en el que dicho reactivo liberador es un reactivo que es capaz de liberar por lo menos 99% de la 25-OH-vitamina D₃ respecto de la proteína ligante de vitamina D.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el metabolito de la vitamina D es 25-OH-vitamina D₃.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha muestra es de suero sanguíneo o plasma sanguíneo.

9. Utilización de un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la evaluación del estatus de vitamina D de un individuo.

10. Kit que comprende un reactivo liberador de la vitamina D y además un metabolito de la vitamina D marcado con un isótopo, en el que dicho metabolito de la vitamina D marcado con un isótopo puede encontrarse presente en formad e componente separado o ya se encuentra contenido dentro del reactivo liberador de la vitamina D y en el que dicho reactivo liberador está basado en una sal que presenta un N-heterociclo cuaternario a modo de catión.