ELABORACION DE MUTANTES DE UNA FOSFATASA ALCALINA, INACTIVOS O DE REDUCIDA ACTIVIDAD Y SU EXPRESION EN LEVADURA.

Mutantes de la fosfatasa alcalina eucariótica, en donde,

- la frecuencia a mutar,

es la SEQ ID NO:2, y

- el mutante, presenta una actividad reducida como mínimo en un factor de 100, en comparación con la del tipo salvaje,

el mutante, presente una o varias de las mutaciones que se citan a continuación, y en donde, la posición de la mutación, se encuentra definida con relación a la SEQ ID NO: 2:

Ser92:por Ala ó Gly

His320:por Asn ó Phe

Gly 322:por Phe ó Lys

Elaboración de mutantes de una fosfatasa alcalina, inactivos o de reducida actividad y su expresión en levadura.

La presente invención, se refiere a un procedimiento para la fabricación recombinante o, respectivamente, la expresión de mutantes de una fosfatasa alcalina eucariótica, los cuales son inactivos de reducida actividad. La invención, se refiere, además, a DNAs con codones optimizados, basados en la secuencia de ácido nucleico, los cuales codifican para una fosfatasa alcalina, altamente activa, y que se modifican mediante una mutagénesis seleccionada como objetivo, de tal forma que, ésta codifique para una fosfatasa alcalina de actividad reducida, o inactiva. La invención, se refiere, además, a un procedimiento para la inserción de los DNA mutantes, en un vector, para la expresión en células de levadura, así como a un procedimiento para la expresión de los mutantes de fosfatasa alcalina.

Las fosfatasas alcalinas (AP), son fosfomonoestearasas no específicas, dímeras, que contienen zinc, las se encuentran tanto en los organismos procarióticos como en los organismos eucarióticos, como por ejemplo, en E. coli y mamíferos (McComb et al., 1979 Alcaline Phosphates, Plenum Press, New York). La comparación de la estructura primaria de las fosfatasas alcalinas, proporcionó un alto grado de homología (un porcentaje del 25-30% de homología, entre E. coli y mamíferos-AP; Millàn, 1988 Anticancer Res. 8, 995-1004; Harris, 1989, Clin. Chim. Acta 186, 133-150).

En los hombres y en los animales superiores, la familia de las AP (fosfatasas alcalinas), consta de cuatro miembros, los cuales se codifican en diversos locus de genes (Millan, 1988, Anticancer Res. 8, 995-1004; Harris, 1989, Clin. Chim. Acta 186, 133-150). A la familia de las fosfatasas alcalinas, pertenecen las APs específicas de tejidos (AP de placenta (PLP), AP de células de gérmenes (GCAP), y AP del intestino (IAP), y la APs no específicas de tejidos (TnAP), las cuales se encuentran principalmente localizadas en el hígado, lo riñones, y los huesos.

Una propiedad determinante de las APs hasta ahora conocidas, es la gran variabilidad en la actividad catalítica de las APs de los mamíferos, las cuales poseen un valor de k_cat, correspondiente a un nivel 10-100 veces mayor que las AP de E. coli. Por debajo de las APs de los mamíferos, las APs del intestino bovino (biAP), son las que presentan las mayores actividades específicas. Esta propiedad, convierte a las biAPs, en atractivas, para la aplicación o utilización bioquímica, como por ejemplo, la aplicación de los correspondientes conjugados enzimáticos como reactivo de diagnóstico, o para la desforolización de DNA. La existencia de diversas fosfatasas alcalinas, procedentes del intestino bovino, con distintas actividades altamente específicas, se describe en el documento de patente europea EP 0 955 363 ó, respectivamente, en Manes et al. (1988), J. Biol. Chem. 273 nº 26, 23353-23360. Hasta ahora, se ha descrito un expresión recombinante de fosfatasas alcalinas eucarióticas de reducida actividad (hasta 3000 U/mg), en diversas líneas celulares eucarióticas como por ejemplo, células CHO (biAP I/WO93/1813 9; Weissig et al. 1993, Biochem J. 260, 503-508), en células COS (humane Placenta-AP/Berger et al., 1987 Biochemistry 84, 4885-4889) o en sistemas de expresión de los Baculovirus (humane Placenta-AP/Davis et al. 1992, Biotechnology 10, 1148-1150). La expresión de APs altamente activas (actividad específica > 3000 U/mg) procedentes del intestino bovino, en células COH (blAP II, III y IV/Manes et al. 1998, J. Biol. Chem. 273 No. 36, 23353-23360), se encuentra también descrita. Un inconveniente de la expresión de fosfatasas alcalinas, en estos sistemas de expresión, reside, no obstante, en el reducido rendimiento o capacidad de expresión, la cual convierte a la fabricación recombinante de fosfatasas alcalinas eucarióticas, en no comercialmente rentables.

Una expresión de fosfatasas alcalinas eucarióticas, en huéspedes de expresión procarióticos, como por ejemplo, E. coli, es de hecho principalmente posible (humane Placenta-AP/Beck and Burtscher, 1994, Protein Expressión and Purification 5, 192-197), pero, no obstante, las fosfatasas alcalinas expresadas en procariotas, no presentan ninguna glicosilación, la cual es esencial, en la fabricación de conjugados enzimáticos, según el procedimiento de conjugación.

Una aplicación frecuente de las fosfatasas alcalinas, como conjugados enzimáticos, es un complejo con un anticuerpo. Junto a ello, la fosfatasa alcalina, se conjuga con un anticuerpo, el cual está dirigido contra un antígeno determinado. En primer lugar, este antígeno, se une, en una primera reacción, a partir de un anticuerpo inmovilizado en la pared vascular, el cual reconoce a otro epítope en el antígeno diana, como un conjugado anticuerpo-AP. Este complejo anticuerpo-antígeno, se identifica entonces, en una segunda reacción, mediante el enlace o unión del conjugado anticuerpo-AP. Mediante los tests de ensayo de ese tipo, se llega siempre a unos resultados de falsos positivos, provocados por un enlace o unión inespecífico del conjugado anticuerpo-AP, con la pared vascular, o con el primer anticuerpo. Estas perturbaciones, puede evitarse mediante la adición de un conjugado con un mutante de AP, inactivo o de reducida actividad, en una cantidad en exceso, como proteína antiparasitaria (de eliminación de las perturbaciones). Con objeto de actuar de una forma muy específica como proteína antiparasitaria (de eliminación de las perturbaciones), es no obstante también un requisito indispensable, además de la reducida actividad, o de la inactividad, una estructura terciaria y cuaternaria de los mutantes de AP, en gran parte igual o semejante.

Correspondientemente en concordancia, la presente invención, tiene la finalidad de producir mutantes de la fosfatasa alcalina, como proteína antiparasitaria, mediante una mutagénesis seleccionada, los cuales son de reducida actividad, o totalmente inactivos, que no obstante, en su secuencia de aminoácidos sólo se encuentran modificados de una forma insignificante, y en la estructura terciara o cuaternaria, de la mejor forma, no se encuentran modificados. Adicionalmente, además, es una finalidad de la presente invención, el desarrollar un procedimiento de expresión, que sea estable y resistente, para la fabricación de mutantes de de fosfatasa alcalina, eucarióticos, glicosilados, los cuales, además, debido a su alto rendimiento o capacidad de expresión, posibiliten una fabricación económicamente rentable de un mutante de fosfatasa alcalina correspondientemente en concordancia.

Son una finalidad de la presente invención, mutantes de la fosfatasa alcalina eucariótica, en donde,

• la frecuencia a mutar, es la SEQ ID NO:2, y

• el mutante, presente una actividad reducida como mínimo en un factor de 100, en comparación con la del tipo salvaje,

• el mutante, presente una o varias de las mutaciones que se citan a continuación, y en donde, la posición de la mutación, se encuentra definida con relación a la SEQ ID NO: 2:

Bajo la definición de mutación de las secuencia de aminoácidos, se entiende la sustitución de los aminoácidos de origen natural, en las posiciones deseadas, por cualquier otro aminoácido, a voluntad, que no impida el pliegue en la correcta estructura terciaria y cuaternaria, y que no obstante, no sean funcionales.

La secuencia a mutar (tipo salvaje), puede ser, por ejemplo, la consistente en una AP intestinal, humana, o una AP de placenta, humana. Adicionalmente, además, en concordancia con la presente invención, como AP de tipo salvaje, entran en consideración una AP infraactiva (es decir, de reducida actividad) o una AP hiperactiva, procedente del intestino bovino. Todas estas enzimas, son por lo menos un 77% homólogas a la SEQ ID NO: 2. La homología, se determinó con un sistema informático de Software, del tipo "Open VMS Vax Version V6.2"; (Copyright (c) 1982-2001, Genetics Computer Group, Inc.; A wholly owned subsidiary of Oxford Molecular Group, Inc. All rights reserved. Published research assisted by this software should cite: Wisconsin Package Version 10.2, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc.).

Los datos de la posición de los aminoácidos a mutar, se refiere...

1. Mutantes de la fosfatasa alcalina eucariótica, en donde,

- la frecuencia a mutar, es la SEQ ID NO:2, y

- el mutante, presenta una actividad reducida como mínimo en un factor de 100, en comparación con la del tipo salvaje,

el mutante, presente una o varias de las mutaciones que se citan a continuación, y en donde, la posición de la mutación, se encuentra definida con relación a la SEQ ID NO: 2:

2. Mutantes de la fosfatasa alcalina eucariótica, según la reivindicación 1, en donde, la enzima, según la secuencia del tipo salvaje, presenta una actividad específica correspondiente a un valor por encima de 7000 U/mg.

3. Mutantes de la fosfatasa alcalina eucariótica, según una de las reivindicaciones 1 y 2, en donde, los mutantes, presentan una actividad disminuida en por lo menos un factor de 1000, en comparación con la secuencia del tipo salvaje.

4. Mutantes de la fosfatasa alcalina eucariótica, según una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde, los mutantes, presentan una actividad disminuida en por lo menos un factor de 10000, en comparación con la secuencia del tipo salvaje.

5. Mutantes de la fosfatasa alcalina eucariótica, según una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde, estos mutantes, presentan una secuencia de aminoácidos, la cual se selecciona de entre las SEQ IC NO's: 4-7.

6. DNA recombinante, que codifica a un mutante de la fosfatasa alcalina eucariótica, según una de las reivindicaciones 1-5.

7. DNA recombinante, que codifica a un mutante de la fosfatasa alcalina eucariótica, en donde, este mutante, presenta una secuencia de ácido nucleico, la cual se elige entre las SEQ ID NO's: 8-11.

8. Vector que contiene una secuencia de ácido nucleico, la cual se elige entre las SEQ ID NO's: 8-11.

9. Vector, según la reivindicación 8, la cual corresponde a un vector, el cual se elige de entre los siguientes vectores: pPICZaA, B, C;pPICZ, pPICZ-E, pPICZa-E; pPIC6, pPIC6aA, B, C; pGAPZ, pGAPZaA, B, C; pPIC9; pPIC9K, pPIC3.5, pPIC3.5K, pAO815, pMET, pMETaA, B, C; pYES-Dest52, pYES2,1/V5-His-TOPO, pYC2-E, pYES2.1-E; vectores Yes,pTEF1/Zeo, pTEF1/Bsd, pNMT-TOPO.

10. Cepa huésped, transformada con un vector según la reivindicación 8 ó 9.

11. Cepa huésped, según la reivindicación 10, en donde, como cepa huésped, se utiliza la Pichia pastoris.

12. Procedimiento para la fabricación de un mutante de la fosfatasa alcalina eucariótica, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 5, en células de levadura, que comprende las etapas de: a) clonación de una secuencia genética según la reivindicación 6 ó 7, en distintos vectores, b) transformación de la levadura, c) expresión de los mutantes de AP, y d) purificación de la fosfatasa alcalina, caracterizado por el hecho de que,

- un primer vector, presenta un gen de resistencia, contra un primer marcador de selección,

- los transformantes, los cuales han integrado el gen de resistencia y la secuencia genética deseada, en el genoma, se seleccionan, mediante el crecimiento sobre un medio nutritivo, con una reducida concentración del primer marcador de selección.

- el número de copias genéticas, se aumenta mediante transformación múltiple, a cuyo efecto, las transformaciones múltiples, se seleccionan, mediante el crecimiento sobre un medio nutritivo, con presión de selección elevada,

- se añade un segundo vector, el cual presenta un gen de resistencia contra un segundo marcador de selección,

- el número de copias genéticas, se aumenta mediante transformación múltiple con el segundo vector, a cuyo efecto, los transformantes múltiples, se seleccionan mediante crecimiento sobre el medio nutritivo, con una presión de selección elevada, y

- se seleccionan aquéllos clones, los cuales han integrado, al genoma, varias copias de la secuencia genética y genes de resistencia al marcador de selección.

13. Procedimiento, según la reivindicación 12, en donde se utilizan células de levadura metilotrofas.

14. Procedimiento, según la reivindicación 13, en donde, como célula de levadura metilotrofa, se utiliza la Pichia Pastoris.

15. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 12-14, en donde, como vector, se utiliza uno de tal tipo que corresponda a un vector, el cual se elije de entre el siguiente grupo de vectores: pPICZaA, B, C; pPICZ, pPICZ-E, pPICZa-E; pPIC6, pPIC6aA, B, C; pGAPZ, pGAPZaA, B, C; pPIC9; pPIC9K, pPIC3.5, pPIC3.5K, pAO815.