Un tubo de muestras para la recolección y procesado de una muestra de sangre total,

conteniendo este tubo de muestras un reactivo para la hemólisis diferencial de dicha muestra de sangre total, en el que dicho reactivo para la hemólisis diferencial comprende una sal y un anti-coagulante, en el que dicha sal se selecciona de entre KBr; KJ; KSCN o una sal que consiste en uno o más de los cationes

Recipiente de recogida de sangre total lista para usar.

La presente invención está relacionada con un tubo de muestras para recoger y procesar una muestra de sangre total. El tubo de muestras contiene un reactivo para hemólisis diferencial de sangre total, en el que dicho reactivo para hemólisis diferencial comprende una sustancia química para hemólisis diferencial y un anticoagulante, y en el que dicho tubo de muestras es un tubo desechable listo para usar. También está relacionada con el uso de dicho tubo de muestras en el procesamiento de una muestra de sangre total para cromatografía líquida y también para el uso de una muestra de sangre procesada en dicho tubo de muestras en un análisis basado en cromatografía líquida.

Antecedentes de la invención

En la rutina de análisis clínicos, la sangre es la fuente más importante de muestras a analizar. Aunque la sangre total es la primera muestra obtenida, la muestra de sangre total normalmente debe procesarse posteriormente para poder permitir una manipulación adecuada o para una detección de analitos fiable.

Cuanto más constituyentes haya en una muestra, más complicado es el análisis de una analito concreto en la muestra. Los hematíes contienen una gran cantidad de proteínas y constituyentes de bajo peso molecular que potencialmente interfieren con cualquier analito a detectar. Esta es una de las principales razones de por qué se utiliza preferiblemente en la rutina de análisis clínicos plasma sanguíneo (a menudo referido para simplificar como plasma, es decir, una muestra de sangre total anticoagulada; sin células ni hematíes) o suero sanguíneo (a menudo referido para simplificar como suero, es decir, sangre total coagulada; sin células, ni hematíes y la mayoría de proteínas del sistema de coagulación, especialmente fibrina/fibrinógeno), respectivamente. Las muestras de sangre total también tienden a ser más difíciles de manipular, por ejemplo, en comparación con el suero o plasma. La sangre total tiende a ser menos estable y la lenta ruptura de los hematíes impide una medición fiable de varios analitos de interés. Además, el transporte y almacenamiento de una muestra de sangre total requiere especiales medidas de precaución.

En el caso de que un analito deba medirse a partir de sangre total, es una práctica general recoger la muestra de sangre total y tratar dicha muestra durante o inmediatamente después de la recogida de sangre con un anticoagulante apropiado. En la rutina de análisis clínicos, se utilizan los tubos pre-rellenados con un anticoagulante apropiado para recoger muestras de sangre total. Como el nombre indica estos anticoagulantes bloquean la activación del sistema de coagulación. Las células sanguíneas y los hematíes permanecerán intactos tanto como sea posible. La sangre anticoagulada debe manipularse con mucho cuidado para evitar problemas provocados, por ejemplo, por la sedimentación de células sanguíneas o hematíes o provocados por la lisis de hematíes. Normalmente se utilizan alícuotas de dichas muestras de sangre total anticoagulada en la detección de un analito de interés, por ejemplo, de un analito que está comprendido, al menos parcialmente, dentro de los hematíes.

Además, en este momento no parece ser factible utilizar una muestra de sangre total en ninguno de los métodos de detección en línea existentes. Por ejemplo, no es posible utilizar una muestra de sangre total en un proceso rutinario de diagnóstico clínico que necesita un paso de separación en base a la cromatografía líquida (CL). La separación por cromatografía líquida de rutina se basa normalmente en una columna que consiste en esencia de una unidad de filtro o tapón de vidrio poroso para proteger el material de la columna y el material de la columna necesario para la separación del (los) analito(s) de interés. Si la sangre total se aplica a dicha columna, la columna se bloqueará tarde o temprano o incluso de forma inmediata, dependiendo del tamaño de la columna y el sistema. Este problema hace prácticamente imposible el uso de sangre total en un proceso de detección en línea en combinación con un método de CL como por ejemplo el preferido en el diagnóstico clínico de rutina. En la actualidad parece que la separación/manejo apropiado de una muestra de sangre, por ejemplo, mediante centrifugación, filtración, precipitación o extracción de analito es esencial, antes de que dicha muestra procesada pueda analizarse de forma adecuada y fiable.

Tal como se ha indicado antes, el suero o plasma puede obtenerse a partir de sangre total y utilizarse en la detección de un analito. Las células y hematíes en teoría pueden también eliminarse mediante filtración o centrifugación a partir de sangre total. No obstante, estos métodos no son apropiados para su uso en el diagnóstico de rutina, ni permitiría una correcta medición de aquellos analitos al menos parcialmente presentes dentro de los hematíes.

En otra forma de procesamiento de muestras, el analito de interés se separa primero de las principales sustancias que potencialmente interfieren, mediante la precipitación selectiva o métodos de extracción. La extracción puede realizarse en fase líquida o en una fase sólida. Esto se puede ejemplificar mediante la ilustración de algunos procedimientos utilizados en la detección de fármacos inmunosupresores.

Los fármacos inmunosupresores son por ejemplo, mofetil micofenolato (MMF), rapamicina (RAPA también conocida como sirolimus) y tacrolimus (FK-506). El fármaco terapéutico para monitorizar fármacos inmunosupresores es especialmente importante para los pacientes trasplantados así como para los pacientes que padecen SIDA (véase por ejemplo: Drug. Ther. Perspect 17 (2001) 8-12). La mayoría de pacientes que se someten a un trasplante de órgano sólido requieren de terapia con inmunosupresores de por vida para prevenir el rechazo de aloinjertos. Pero, debido a que la mayoría de agentes inmunosupresores presentan rangos terapéuticos estrechos, también denominados como ventana terapéutica, y están asociados con diferentes toxicidades y el potencial para las interacciones con otros fármacos, es particularmente importante la monitorización de fármacos (TDM) junto con la evaluación clínica de los pacientes.

El mofetil micofenolato es un profármaco. Tras la administración oral, el mofetil micofenolato (MMF) sufre una hidrólisis rápida en el intestino y en la sangre para formar su metabolito activo, el ácido micofenólico (MPA). El MMF está disponible ampliamente y está aprobado en los EE.UU. y Reino Unido para la prevención del rechazo de aloinjerto renal, hepático o cardíaco en combinación con corticosteroides y ciclosporina. El fármaco ha demostrado superioridad sobre la azatioprina en reducir la incidencia de rechazo agudo de aloinjertos renales. La concentración mínima terapéutica está en el rango de 1-3,5 mg/L. MMF puede medirse desde plasma y desde sangre total.

Tacrolimus es un antibiótico macrólido que se aprobó por primera vez por la Administración de fármacos y alimentos de EE.UU. (FDA) en 1994 para la prevención del rechazo de aloinjerto de hígado. Es hasta 100 veces más potente que la ciclosporina in vitro, y clínicamente, está asociada con una mayor reducción en la incidencia de rechazo de tejido. Tacrolimus ha demostrado eficacia tanto como terapia inmunosupresora primaria en pacientes que padecen varios procesos de trasplante y como terapia de rescate para pacientes con rechazo de aloinjerto agudo refractario tras el trasplante de hígado o riñón. La concentración mínima terapéutica está en el rango De 5-20 µg/L.

Debido a que al menos parte del tacrolimus presente en la circulación está compartimentado en los hematíes, se utiliza una muestra de sangre total en la rutina de medición clínica de este fármaco. Tacrolimus puede por ejemplo, detectarse mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), espectrometría de masas por HPLC (EM), ensayo de receptores de radioligandos (RRA), o mediante un inmunoensayo (IA). Las últimas dos metodologías no detectan tacrolimus y algunos de sus diferentes metabolitos con la misma sensibilidad. Esto puede llevar a una interferencia en el procedimiento utilizado (Murthy, J. N., et al., Clin. Biochem. 31 (1998) 613-617). Al menos en la detección de los diferentes metabolitos de tacrolimus, el procedimiento de HPLC-EM puede considerarse la norma común. Todos los procedimientos mencionados antes, no obstante, requieren de la extracción de tacrolimus a partir de sangre total. Normalmente se utiliza acetonitrilo en la rutina clínica para la extracción de tacrolimus a partir...

1. Un tubo de muestras para la recolección y procesado de una muestra de sangre total, conteniendo este tubo de muestras un reactivo para la hemólisis diferencial de dicha muestra de sangre total, en el que dicho reactivo para la hemólisis diferencial comprende una sal y un anti-coagulante, en el que dicha sal se selecciona de entre KBr; KJ; KSCN o una sal que consiste en uno o más de los cationes

en los que m es 0 o 1 y n es 4 o 6 y los aniones son cloruro, tetrafluoroborato, octilsulfato, yoduro y/o tiocianato, en el que dicho tubo de muestras es un tubo listo para su uso y de un solo muestreo, y en el que dicha hemólisis diferencial está presente si 50 alícuotas de 10 µL de hemolisado, es decir, una muestra de sangre diluída 1:10 en salina fisiológica y mezclado 1:1 con dicho reactivo para la hemólisis diferencial, puede aplicarse en un filtro de un sistema de HPLC con un diámetro de 2 mm y 0,5 µm de tamaño de poro sin bloquear dicho filtro.

2. El tubo de muestras de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho reactivo para la hemólisis diferencial causa la lisis de las membranas celulares de los hematíes y que al mismo tiempo no provoca una precipitación de los constituyentes de la muestra.

3. El tubo de muestras de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que dicho reactivo para la hemólisis diferencial comprende adicionalmente un inhibidor de proteasas.

4. La utilización del tubo de muestras de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el procesado de una muestra de sangre total para la cromatografía líquida.

5. La utilización de una muestra de sangre procesada obtenida mediante una hemólisis diferencial con un tubo de muestras de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en un análisis basado en la cromatografía líquida.