Un método para purificar adenovirus de contaminantes en un conjunto de muestras,

que comprende:

poner en contacto el conjunto de muestras con un medio de cromatografía de hidroxiapatita para que el adenovirus se una de manera reversible a la hidroxiapatita; y

eluir de la hidroxiapatita el adenovirus unido,

en el que la concentración de cloruro de sodio presente en los tampones usados es de al menos 150 mM

Método para purificar adenovirus.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a métodos para purificar adenovirus de una muestra contaminada usando un medio de cromatografía de hidroxiapatita.

Antecedentes de la invención

En muchas aplicaciones de terapia génica los adenovirus se prefieren como un vector para suministrar gen terapéutico. El cultivo y la purificación de adenovirus que contienen los genes terapéuticos, tales como los genes supresores de tumores y otros modificadores de la respuesta biológica, se ha vuelto cada vez más importante para la terapia génica y el desarrollo de vacunas. A medida que los estudios de terapia génica avanzan hacia ensayos clínicos, se necesitan grandes cantidades de vectores virales purificados para suministrar gen terapéutico en el tratamiento. El diámetro relativamente grande (aproximadamente 80 nm) y la frágil estructura de los adenovirus hacen difícil su purificación usando métodos convencionales, por ejemplo, centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio y cromatografía de filtración en gel, que tienen limitaciones a escala. Se conocen protocolos de cromatografía para purificar adenovirus vivos, por ejemplo, véase la Patente de Estados Unidos Nº 5.837.520, sin embargo, en las preparaciones de virus que usan estos protocolos se encuentran pequeñas cantidades de proteínas contaminantes y de partículas virales incompletas, por ejemplo, cápsides vacías. Este problema es significativo ya que las cápsides vacías y otras proteínas contaminantes pueden ser inmunogénicas in vivo. Por lo tanto, sería ventajoso tener un proceso eficaz que proporcione una muestra de virus viable altamente purificada, que reduzca significativamente al mismo tiempo niveles de partículas virales incompletas. El documento WO 9 708 298 describe un método de purificación de adenovirus en hidroxiapatita que tiene un rendimiento inferior al 10%. La pureza del virus mejorada sin sacrificar el rendimiento del virus sería beneficiosa en la producción del adenovirus a gran escala.

Por tanto, existe una necesidad en la técnica de métodos de purificación mejorados para adenovirus que pueda resolver virus vivos de partículas virales incompletas y otras proteínas contaminantes en la preparación viral. La presente invención aborda esta y otras necesidades en la técnica.

Sumario de la invención

Esta invención proporciona un método para purificar adenovirus biológicamente activos de una muestra contaminada usando un medio de hidroxiapatita en condiciones que permiten que el adenovirus se una de manera reversible a la hidroxiapatita mientras que se pasan los contaminantes. El presente método de purificación reduce en gran medida el nivel de contaminantes y cápsides de adenovirus vacías de las muestras de adenovirus purificando primero por métodos de purificación convencionales. Para impedir que el adenovirus se una de manera irreversible a la hidroxiapatita la concentración de cloruro de sodio presente en los tampones usados durante el método es de al menos 150 mM. Menores concentraciones de cloruro de sodio pueden causar que el adenovirus se una de manera irreversible a la hidroxiapatita.

Es una ventaja de un método de la invención que las cápsides vacías, es decir, partículas virales incompletas, que no son infecciosas y por tanto no útiles para la terapia génica u otras aplicaciones, se separen de los virus intactos. De esta manera, se proporciona una muestra de adenovirus infecciosa altamente purificada y resuelta.

Por tanto, se proporciona un método para purificar adenovirus biológicamente activos de un conjunto de muestras contaminadas, que incluye las etapas de poner en contacto el conjunto de muestras con un medio cromatográfico de hidroxiapatita para unir de manera reversible el adenovirus biológicamente activo a la hidroxiapatita, seguido de la elución del adenovirus biológicamente activo unido de la hidroxiapatita.

En una realización específica, el conjunto de muestras usado en un método de la invención contiene una solución tamponada que incluye fosfato de sodio aproximadamente 50 mM, pH aproximadamente 7,5, cloruro de sodio aproximadamente 400 mM, sacarosa aproximadamente al 2%, MgCl₂ aproximadamente 2 mM y glicerol aproximadamente al 10%.

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con la presente invención, se pueden emplear técnicas de biología molecular, microbiología o de ADN recombinante dentro de la experiencia habitual de la técnica para preparar, desarrollar y cultivar virus usados en un método de la invención. Dichas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and 11 (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis [M. J. Gait ed. (1984)]; Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; A Practical Guide To Molecular Cloning [B. Perbal (1984)]; Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., F. M. Ausubel et al., eds., 1994; Virology: A laboratory manual. Academic Press, New York, (Burleson, ed., 1992).

Esta invención proporciona un método para purificar adenovirus biológicamente activos de viriones incompletos y diversos contaminantes de proteínas no virales y virales en una muestra usando un medio de hidroxiapatita.

El término "contaminante" significa una impureza indeseable en una muestra que contiene adenovirus, por ejemplo, una cápside vacía (que es una partícula viral inmadura sin ADN viral y que contiene precursores para madurar proteínas virales tales como pVIII, y que no es capaz de adherirse o penetrar en una célula adecuada), una molécula de ácido nucleico, una proteína viral libre (por ejemplo, proteínas virales III o hexones), una proteína no viral (por ejemplo, proteínas derivadas de hospedadores o medios tales como BSA, que es un componente de los cultivos celulares habituales en sistemas de mamíferos). Una ventaja del presente método de purificación es que el medio de hidroxiapatita usado en condiciones salinas y de tampón de acuerdo con la invención reduce el nivel de partículas virales incompletas en la muestra de adenovirus.

El término "purificar" y las variaciones gramaticales del mismo, cuando se utiliza en referencia a un método de la presente invención, significa al menos una reducción del 50% de contaminantes totales, en particular, proteínas no virales y virales libres, en una muestra de adenovirus, cuantificada por cromatografía en gel con SDS con tinción de plata, sobre una muestra de adenovirus que se purifica usando un método de purificación convencional (es decir, un método de purificación conocido en la técnica que no sea el uso de hidroxiapatita, por ejemplo, cromatografía con DEAE) antes de una etapa de purificación de la presente invención. Preferiblemente la reducción de contaminantes totales es al menos del 80%. Más preferiblemente, la reducción de contaminantes totales es del 90% o superior. La reducción de cápsides vacías es al menos del 50%, preferiblemente del 75%, más preferiblemente del 80% y más preferiblemente del 85% o superior, cuantificado usando HPLC de fase inversa midiendo un precursor de proteína viral para la proteína VIII del adenovirus ("pVIII") [véase Galibert et al., Gene 6: 1 (1979) y Herisse et al., Nucl. Acids Res. 8: 2173 (1980)], que no se encuentra en adenovirus maduros infecciosos. Cabe señalar que un método de la presente invención que se realiza a escala para la producción comercial puede dar como resultado reducciones porcentuales ligeramente inferiores, preferiblemente reducciones inferiores no superiores del 5 al 10%.

Cualquier adenovirus puede purificarse mediante la presente invención, tanto si se trata de tipo silvestre, mutante o recombinante. Los vectores adenovirales de Tipo 2 y de Tipo 5 son los preferidos. Los adenovirus pueden prepararse y cultivarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, véase Wills et al., Hum. Gene Ther. 5: 1079-1088 (1994), Hughye et al. Hum. Gene Ther. 6: 1403-1416 (1995), y manuales de laboratorio según se ha descrito, anteriormente.

Los adenovirus purificados mediante el presente método son "infecciosos", que significa que comprenden una cápside...

1. Un método para purificar adenovirus de contaminantes en un conjunto de muestras, que comprende:

2. El método de la reivindicación 1, en el que el conjunto de muestras comprende cloruro de sodio a una concentración de 150 a 500 mM.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el medio cromatográfico de hidroxiapatita se equilibra con un tampón que comprende cloruro de sodio a una concentración de 150 a 500 mM antes de la etapa de poner en contacto el conjunto de muestras con la hidroxiapatita.

4. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la etapa de lavar la hidroxiapatita con un tampón que comprende cloruro de sodio en una concentración de 150 a 500 mM, en el que la hidroxiapatita comprende un adenovirus unido a ella.

5. El método de la reivindicación 1, en el que el adenovirus se eluye usando un tampón que comprende cloruro de sodio en una concentración de 150 mM a 500 mM.

6. El método de la reivindicación 1 en el que la concentración de cloruro de sodio en un tampón usado en el método es de 350 mM a 450 mM.

7. El método de la reivindicación 1, en el que el conjunto de muestras se prepara a partir de un eluato de un medio de cromatografía convencional.

8. El método de la reivindicación 7 en el que el medio de cromatografía convencional es:

9. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de elución es una elución en gradiente con fosfato 600 mM.

10. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de elución es una elución por etapas con fosfato 250 mM.

11. El método de la reivindicación 1, en el que un tampón usado en el método comprende glicerol o sacarosa.

12. El método de la reivindicación 1, en el que la concentración de adenovirus en el conjunto de muestras es igual o inferior a 1 x 10¹⁴ partículas por ml.

13. El método de la reivindicación 1, en el que el adenovirus comprende un gen terapéutico.

14. El método de la reivindicación 1, en el que el adenovirus es ACN53.

15. El método de la reivindicación 1, en el que el adenovirus comprende una secuencia de ácido nucleico del gen p53 o del gen p21.

16. Un método de la reivindicación 1, que reduce la concentración de un contaminante en el conjunto de muestras al menos un 80%.

17. Un método de la reivindicación 1, que reduce la concentración de cápsides vacías al menos un 75%.

18. Un método de la reivindicación 1, que reduce la concentración de BSA al menos un 70%.

19. Un método para purificar adenovirus de contaminantes en un conjunto de muestras, que comprende: