Un método para la síntesis de un polinucleótido bicatenario sin el uso de ningún ADN recombinante o de origen natural existente,

que comprende los pasos de

a)generar una primera serie de oligonucleótidos correspondiente a la cadena positiva completa de dicho polinucleótido bicatenario;

b)generar una segunda serie de oligonucleótidos correspondiente a la cadena negativa completa de dicho polinucleótido bicatenario y

c)hibridar dicha primera y segunda series de oligonucleótidos;

donde el paso (c) comprende los pasos de

i)hibridar el oligonucleótido del extremo 5'' de dicha primera serie de oligonucleótidos con el oligonucleótido del extremo 3'' de dicha segunda serie de oligonucleótidos,

ii)hibridar el próximo oligonucleótido más cerca del extremo 5'' de dicha primera serie de oligonucleótidos con el producto del paso (i),

iii)hibridar el próximo oligonucleótido más cerca del extremo 3'' de dicha segunda serie de oligonucleótidos con el producto del paso (ii),

iv)repetir el proceso hasta que todos los oligonucleótidos de dichas primera y segunda serie de oligonucleótidos se hayan hibridado,

donde cada uno de dichos oligonucleótidos de dicha segunda serie de oligonucleótidos se solapa con e hibrida a dos oligonucleótidos complementarios de dicha primera serie de oligonucleótidos, con la excepción de que dos oligonucleótidos en el extremo 5'' o 3'' de dicho polinucleótido bicatenario se hibridará con sólo un oligonucleótido complementario

Método para la síntesis química completa y ensamblaje de genes y genomas.

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere de forma general a los campos de la síntesis de oligonucleótidos. Más particularmente, se refiere al ensamblaje de genes y genomas de organismos artificiales completamente sintéticos.

2. Descripción de la técnica relacionada

La actual investigación y las aplicaciones comerciales en biología molecular se basan en ADN recombinante desarrollado en los años setenta. Una faceta crítica del ADN recombinante es la clonación molecular en plásmidos, cubiertos por la patente seminal de Cohen y Boyer (Patente de Estados Unidos 4.740.470 "Biologically functional molecular chimeras"). Esta patente muestra un método para "cortar y empalmar" moléculas de ADN a partir de endonucleasas de restricción, de la introducción de estas moléculas "recombinantes" en células hospedadoras y su replicación en los hospedadores bacterianos. Esta técnica es la base de toda la clonación molecular con fines de investigación y comerciales llevada a cabo a lo largo de los últimos 20 años y la base del campo de la genética y la biología moleculares.

La tecnología de ADN recombinante es una tecnología poderosa, pero su utilidad se limita a modificaciones de secuencias de ADN existentes que se modifican a través de 1) sitios de escisión de enzimas de restricción, 2) cebadores PAC para amplificación, 3) mutagénesis específica del sitio y otras técnicas. La creación de una molécula totalmente nueva o la modificación sustancial de moléculas existentes, requiere mucho tiempo, resulta cara y exige pasos complejos y múltiples y en algunos casos resulta imposible. La tecnología de ADN recombinante no permite la creación de moléculas, genes, genomas u organismos totalmente artificiales, sino únicamente modificaciones de organismos de origen natural.

La actual biotecnología para producción industrial, diseño y desarrollo de fármacos, para aplicaciones potenciales de desarrollo de vacunas y terapia génica y para la utilización agrícola y medioambiental de ADN recombinante depende de organismos y moléculas de ADN de origen natural. La creación o el desarrollo de funciones nuevas o novedosas o la modificación de organismos para un uso especializado (como la producción de una hormona humana), exige manipulaciones difíciles, sustancialmente complejas, que requieren mucho tiempo, de moléculas de ADN de origen natural. En algunos casos, los cambios del ADN de origen natural son tan complejos que no resultan posibles en la práctica. De este modo, es necesaria una tecnología que permita la creación de moléculas de ADN nuevas en un solo paso sin requerir la utilización de ningún ADN recombinante o de origen natural.

WOSNICK M A ET AL se refieren a síntesis química total y expresión en E. coli de un gen de glutatión transferasa (GST) (GENE, vol. 76, 1984, páginas 153-160). L. D. BELL ET AL se refieren a síntesis química, clonación y expresión en células de mamífero de un gen que codifica activador de plasminógeno de tipo tisular humano (GENE, vol. 63, 1988, páginas 155-163). M. D. EDGE ET AL. se refieren a síntesis total de un gen de interferón de leucocito humano (NATURE, vol. 292, 20 de agosto de 1981 (20-08-1981), páginas 756-762). L. FERRETTI ET AL. se refieren a síntesis total de un gen de rodopsina bovina (PROC. NATL. ACAD. SCI., vol. 83, febrero de 1996 (02-1996), páginas 599-603). LASHKARI D A ET AL se refieren a un sintetizador de oligonucleótidos multiplex automatizado y el desarrollo de síntesis de ADN de alto rendimiento y bajo coste (PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, vol. 92, Nº 17,15 de agosto de 1995 (15-08-1995), páginas 7912-7915). L. E. SINDELAR Y J. M. JAKLEVIC describen síntesis de ADN de alto rendimiento en un formato multicanal (NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 23, Nº 6, 1995, páginas 982-987). S. RAYNER ET AL. describen MerMade, un sintetizador de oligodesoxirribonucleótido para producción de oligonucleótidos de alto rendimiento en placas dobles de 96 pocillos (GENOME RESEARCH, vol. 8, Nº 7, julio de 1998 (1998-07), páginas 741- 747).

El documento EP 0385410 se refiere a un método para formar un oligonucleótido que comprende los pasos de sintetizar un par de oligonucleótidos complementarios, unir el par de oligonucleótidos en las porciones de secuencia de base complementaria y polimerizar bases de ácido nucleico en el par de oligonucleótidos resultante. El documento EP 0316018 muestra la modificación de una secuencia de ADN digiriendo una secuencia de ADN de vector con una enzima de restricción, retirando cualquier nucleótido indeseado, tratando el vector escindido con exonucleasa III para crear extremos cohesivos de 5 min, mezclando con el vector tratado de este modo un número par de nucleótidos de cadena única de secuencia alterna sentido y antisentido que codifican alternativamente o que son complementarios a las secuencias deseadas en el ADN de producto y donde estos oligonucleótidos de cadena única tienen extremos que se solapan y son complementarios a extremos del oligonucleótido u oligonucleótidos adyacentes y/o los extremos cohesivos de 5 min de vector. El documento W09412632 se refiere a un método para sintetizar ácido nucléico mediante una reacción en cadena de la polimerasa realizada en una serie de cebadores solapantes que abarcan la longitud completa del ácido nucleico que se tiene que sintetizar. El documento WO 9000626 se refiere a la construcción de un conjunto de fase sólida de biopolímeros a través del ensamblaje de secuencias de biopolímero más cortas, por ejemplo, ensamblaje de genes de oligonucleótidos.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a las limitaciones en las actuales manipulaciones de ácido nucleico recombinante proporcionando un medio rápido y eficaz para generar prácticamente cualquier secuencia de ácido nucleico, incluyendo genes enteros, segmentos de cromosomas, cromosomas y genomas. Habida cuenta de que este enfoque se basa en un enfoque completamente sintético, no existen limitaciones, tales como la disponibilidad de ácidos nucleicos existentes, que supongan un obstáculo para la construcción de segmentos incluso muy amplios de ácido nucleico.

La invención proporciona un método para la síntesis de un polinucleótido sin el uso de cualquiera de una diversidad de ADN recombinante o de origen natural, que comprende los pasos de

donde el paso (c) comprende los pasos de

donde cada uno de dichos oligonucleótidos de dicha segunda serie de oligonucleótidos se solapa con e hibrida a dos oligonucleótidos complementarios de dicha primera serie de oligonucleótidos, con la excepción de que dos oligonucleótidos en el extremo 5' o 3' de dicho polinucleótido se hibridará con sólo un oligonucleótido complemen- tario.

La invención proporciona además un método para sintetizar un polinucleótido bicatenario, que comprende: (a) hibridar un oligonucleótido del extremo 5' con un oligonucleótido del extremo 3' de un polinucleótido bicatenario para producir un primer producto hibridado y añadir directamente un oligonucleótido siguiente 5' más terminal de dicho polinucleótido bicatenario a dicho...

1. Un método para la síntesis de un polinucleótido bicatenario sin el uso de ningún ADN recombinante o de origen natural existente, que comprende los pasos de

donde el paso (c) comprende los pasos de

donde cada uno de dichos oligonucleótidos de dicha segunda serie de oligonucleótidos se solapa con e hibrida a dos oligonucleótidos complementarios de dicha primera serie de oligonucleótidos, con la excepción de que dos oligonucleótidos en el extremo 5' o 3' de dicho polinucleótido bicatenario se hibridará con sólo un oligonucleótido complementario.

2. Un método para sintetizar un polinucleótido bicatenario, que comprende: (a) hibridar un oligonucleótido del extremo 5' con un oligonucleótido del extremo 3' de un polinucleótido bicatenario para producir un primer producto hibridado y añadir directamente un oligonucleótido siguiente 5' más terminal de dicho polinucleótido bicatenario a dicho primer producto hibridado en condiciones suficientes para hibridación para producir un segundo producto hibridado, teniendo dicho oligonucleótido siguiente más terminal una longitud de al menos aproximadamente 25 bases y (b) repetir el paso (a) una o más veces para producir en secuencia un polinucleótido bicatenario.

3. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, comprendiendo además los pasos de tratar dichos oligonucleótidos hibridados con una enzima de ligamiento para generar cadenas continuas de dicho polinucleótido bicatenario.

4. El método de la reivindicación 3, donde la enzima de ligamiento es topoisomerasa.

5. El método de la reivindicación 3, donde la enzima de ligamiento es ADN ligasa T4.

6. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, comprendiendo además el paso de amplificar dicho polinucleótido bicatenario.

7. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicho polinucleótido bicatenario comprende 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5000, 10x10³, 20x10³, 30x10³, 40x10³, 50x10³, 60 x10³, 70 x10³, 80x10³, 90x10³, 1x10⁵, 1 x 10⁶, 1 x 10⁷ ó 1x10⁸ pares de bases de longitud.

8. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicho polinucleótido bicatenario comprende una o más secuencias codificantes y uno o más elementos reguladores.

9. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicho polinucleótido bicatenario es un ADN.

10. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicho polinucleótido bicatenario es un ARN.

11. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicho polinucleótido bicatenario es una construcción de expresión.

12. El método de la reivindicación 11, donde dicha construcción de expresión es una construcción de expresión bacteriana.

13. El método de la reivindicación 11, donde dicha construcción de expresión es una construcción de expresión de mamífero.

14. El método de la reivindicación 11, donde dicha construcción de expresión es una construcción de expresión viral.

15. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicho solapamiento entre los oligonucleótidos de dicha primera y dicha segunda serie de oligonucleótidos está entre 5 pares de bases y 75 pares de bases.

16. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicho solapamiento es de 10 pares de bases, 15 pares de bases, 20 pares de bases, 25 pares de bases, 30 pares de bases, 35 pares de bases, 40 pares de bases, 45 pares de bases, 50 pares de bases, 55 pares de bases, 60 pares de bases, 65 pares de bases o 70 pares de bases.