METODO PARA LA IDENTIFICACION DE LINAJES MATERNOS DE PERDIZ RIOJA (ALECTORIS RUFA), PERDIZ TURCA (ALECTORIS CHUKAR) Y PERDIZ GRIEGA (ALECTORIS GRAECA).

Método para la identificación de linajes maternos de perdiz roja (Alectoris rufa),

perdiz turca (Alectoris chukar) y perdiz griega (Alectoris graeca), basado en una técnica de análisis de ADN mitocondrial caracterizada por la digestión con la enzima de restricción Tsp45I de un fragmento de ADN de 234 pb, dentro de la región hipervariable I (Dominio 1) de la región control del ADN mitocondrial, amplificado por PCR con una pareja de secuencias específicas de oligonucleótidos. Los productos obtenidos por este método permiten diferenciar los tipos mitocondriales de las tres especies, tanto en los individuos puros como en los híbridos, de forma sencilla, rápida y precisa. Este tipo de prueba genética puede ser empleado para la detección de híbridos prohibidos por la legislación, como estimador del grado de contaminación genética de poblaciones naturales o gestionadas y, por extensión, como control de la pureza de éstas

Método para la identificación de linajes maternos de perdiz roja (Alectoris rufa), perdiz turca (Alectoris chukar) y perdiz griega (Alectoris graeca).

El objeto de la presente invención es un método para la identificación de linajes maternos de perdiz roja (Alectoris rufa), perdiz turca (Alectoris chukar) y perdiz griega (Alectoris graeca), basado en el aislamiento e identificación del ADN mitocondrial (linaje materno) específico de las mismas, a partir de plumas y manchas de sangre obtenidas de las aves.

Los productos obtenidos por este método permiten diferenciar los tipos mitocondriales de las tres especies de perdiz, tanto en los individuos puros como en los híbridos, de forma sencilla, rápida y precisa. Esto satisface la finalidad principal perseguida con el mismo por los inventores desde un principio, que es la de disponer de un procedimiento útil para poder identificar el linaje materno específico de la perdiz roja, autóctona de la Península Ibérica, para diferenciarla de las perdices griega y turca, con vistas a su aplicación tanto en la detección de híbridos prohibidos, como en la garantía de calidad de pureza genética de las poblaciones, dándose así una solución al problema actual de la utilización fraudulenta e incontrolada de las dos especies foráneas de perdiz que están entrando en nuestro país a través de repoblaciones incontroladas y sueltas de aves con fines cinegéticos en los cotos de caza.

La invención encuentra, por tanto, directa aplicación en el sector cinegético, tanto en granjas de cría como en cotos de caza, siendo también de interés en todos los ámbitos relacionados con la conservación de la fauna autóctona y la biodiversidad.

Estado de la técnica

La perdiz roja (Alectoris rufa) es la especie de caza menor más emblemática en la Península Ibérica. La fuerte demanda cinegética supera ampliamente la producción de las poblaciones naturales, por lo que son numerosas las granjas de cría de perdiz repartidas por el territorio nacional. Se estima que de los aproximadamente cinco millones de ejemplares cazados anualmente en España, el 80 por ciento hbox{son aves criadas en cautividad y liberadas luego en los cotos.

En la perdiz roja (A. rufa), el cuello es blanco con una franja negra que se extiende hacia abajo en estrías o salpicaduras. En sus flancos se aprecian las características bandas transversales donde alternan los colores rojo, blanco y gris perla, ribeteados de una única fina línea negra. El pico, al anillo orbital y las patas son rojas, éstas en algunas ocasiones presentan un pequeño espolón.

Morfológicamente, la perdiz roja es bastante diferenciable de otras razas de perdiz, como son la turca (A. chukar) y la griega (A. graeca).

A. graeca se diferencia de A. rufa en que la mancha blanca de la garganta es más grande y tiene una orla negra patente y bien delimitada. Las partes superiores son pardo grisáceas, en vez de pardo-rojizas. En A. chukar el franjeado del flanco es más marcado y el collar negro alrededor de la garganta moteada, de color blanco grisáceo, no rodea al pico como en A. graeca.

Aunque la única especie autóctona de perdiz en la Península Ibérica es A. rufa., debido a que A. graeca y A. chukar presentan ciertas ventajas para la cría masiva en cautividad, estas especies, así como sus híbridos con A. rufa, se están utilizando fraudulentamente en repoblaciones y sueltas de perdices con fines cinegéticos, lo que está suponiendo un importante riesgo de hibridación de la perdiz roja española con la perdiz griega (A. graeca) y con la perdiz turca (A. chukar). De hecho, existen numerosas sospechas, denunciadas por las asociaciones de cazadores, en torno a la contaminación genética de la perdiz roja.

Este peligro es uno de los principales problemas que afectan hoy a las poblaciones de perdiz. Tanto es así, que las legislaciones de los países europeos, incluyendo la española, prohíben la liberación de especies, subespecies y razas alóctonas, especialmente si conllevan riesgos de hibridación que alteren la pureza genética de las autóctonas (RD 1118/1989 de 15 de septiembre, Artículo 3). Sin embargo, el hecho de que las especies foráneas (particularmente la perdiz turca) ofrezcan una mayor facilidad de cría en cautividad, convierte tal hibridación en práctica tentadora. La mayor diferencia se debe a la capacidad ponedora, ya que mientras la perdiz roja pone alrededor de 15 huevos, la perdiz turca puede poner de 40 a 50 en cada estación.

Si bien es cierto que, como se ha visto arriba, es relativamente fácil identificar a las tres especies de perdiz entre sí, dado sus peculiares características morfológicas, la distinción de los híbridos de primera generación ya no resulta tan evidente y mucho más dudosa la de sucesivas generaciones.

En la actualidad no hay ninguna técnica para la identificación rápida y fiable de los híbridos de perdiz y, por tanto, para dar una solución a este problema de introgresión entre las distintas especies, pese a la insistente demanda del sector cinegético, cuando continuamente se refieren al mismo en términos como "pureza" y "contaminación" genética, que podrían llevar en el futuro a establecer una "denominación de origen" de las piezas de caza, que certifique la calidad y origen del producto, con el consiguiente aumento de su valor de mercado.

Tales pruebas de identificación requieren técnicas de diagnóstico basadas en el ADN, con su exquisita sensibilidad, rapidez y precisión, sin que requieran un equipo costoso. Dado que las ventajas de cría están precisamente en una puesta de huevos más eficiente por las hembras de las especies alóctonas, la identificación de linajes maternos es especialmente necesaria. Esto se puede lograr a través del análisis del ADN mitocondrial (ADNmt) que se transmite exclusivamente por vía materna.

El genoma mitocondrial es la pequeña molécula de ADN circular que poseen las mitocondrias, orgánulos celulares donde ocurren las reacciones bioquímicas de la respiración, encaminadas a la producción de energía. Las mitocondrias se encuentran en el citoplasma celular y, salvo raras excepciones, se transmiten a los descendientes únicamente por el lado femenino ya que los espermatozoides no aportan citoplasma en la fecundación. El genoma mitocondrial contiene algunos de los genes involucrados en la respiración celular así como algunas regiones no codificantes. Una de ellas es la región control o D-loop, que incluye el origen de replicación del genoma mitocondrial y presenta algunos segmentos de secuencia conservada y otros de secuencia muy variable. Estos últimos se han utilizado en numerosas ocasiones en análisis filogenéticos moleculares.

Debido a su transmisión exclusivamente femenina, las secuencias mitocondriales no se combinan y perduran intactas a través de las generaciones, siempre que se siga la línea matrilineal. Por esta razón, permiten detectar introgresión entre especies incluso mucho tiempo después de que se haya producido la primera hibridación.

Son numerosos los artículos publicados en relación con estudios filogeográficos y filogenéticos basados en el análisis del ADN mitocondrial de diferentes especies animales, incluido especies alóctonas. Entre ellos se encuentran artículos de los propios autores del estudio que ha dado lugar al presente proyecto. También existen disposiciones oficiales relacionadas con este campo. Entre toda esta bibliografía, podemos destacar la siguiente:

1. Método para la identificación de linajes maternos de perdiz roja (Alectoris rufa), perdiz turca (Alectoris chukar) y perdiz griega (Alectoris graeca) a partir de muestras biológicas de los individuos a ensayar, como pueden ser plumas o manchas de sangre, basado en la técnica de aislamiento e identificación de ADN mitocondrial en estudios filogenéticos, que conlleva las etapas de: 1) Obtención de la muestra biológica, 2) extracción de ADN para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), 3) amplificación por PCR de un fragmento de ADN presente en el ADN extraído, 4) comprobación de la amplificación, analizando la presencia o ausencia de amplicones, 5) digestión de amplicones, y 6) estudio de los fragmentos de restricción resultantes; estando caracterizado esencialmente porque el fragmento de ADN para amplificación por PCR (etapa 3) es un segmento de 234 pares de bases (pb), denominado ALEC, situado dentro de la región hipervariable I (Dominio 1) de la región control del ADN mitocondrial (ADNmt) en Alectoris rufa, Alectoris graeca y Alectoris chukar, porque dicha ampliación por PCR es realizada mediante el empleo de los cebadores identificados como mtALEC-U y mtALEC-L cuyas secuencias de nucleótidos corresponden a las SEC.ID. Nº:1 (AACCCATTAT ATGTAGACGG A) y SEC-ID Nº: 2 (CTGATCTCTC GTGAGGTGT), respectivamente, o con secuencias de oligonucleótidos que representen versiones más cortas o largas de los mismos siempre que sean específicos de dicha región, porque la digestión de amplicones (etapa 5) es realizada con enzimas de restricción cuya secuencia diana sea 5'-GTSAC-3', que es diagnóstica de especies, y porque los productos de digestión enzimática resultantes para el análisis final frente al conjunto de patrones de fragmentos de restricción (etapa 6), son constantes dentro de cada especie, de modo que: a) la aparición de dos fragmentos de 119 y 115 pb es indicativa de ADNmt de la perdiz roja, Alectoris rufa, b) la aparición de dos fragmento de 138 y 96 pb es indicativa de ADNmt de la perdiz turca, Alectoris chukar, y c) la aparición de un solo fragmento de 234 pb es indicativa de ADNmt de la perdiz griega, Alectoris graeca.

2. Método para la identificación de linajes maternos de perdiz roja (Alectoris rufa), perdiz turca (Alectoris chukar) y perdiz griega (Alectoris graeca), según la reivindicación 1, en el que la PCR se realiza mediante el siguiente programa de ciclos de temperatura:

3. Método para la identificación de linajes maternos de perdiz roja (Alectoris rufa), perdiz turca (Alectoris chukar) y perdiz griega (Alectoris graeca), según la reivindicación 1, en el que el análisis de los productos de la digestión enzimática se lleva a cabo mediante separación electroforética de los fragmentos.

4. Método para la identificación de linajes maternos de perdiz roja (Alectoris rufa), perdiz turca (Alectoris chukar) y perdiz griega (Alectoris graeca), según la reivindicación 1, en el que se utiliza para la digestión de los amplicones la enzima de restricción Tsp45-I, específica para la secuencia 5'-GTSAC-3'.

5. Método para la identificación de linajes maternos de perdiz roja (Alectoris rufa), perdiz turca (Alectoris chukar) y perdiz griega (Alectoris graeca), según la reivindicación 1, en el que el procedimiento para la comprobación de la eficacia de la amplificación es la electroforesis en gel de agarosa.

6. Método para la identificación de linajes maternos de perdiz roja (Alectoris rufa), perdiz turca (Alectoris chukar) y perdiz griega (Alectoris graeca), según la reivindicación 1, en el que la ampliación por PCR se realiza mediante el empleo de los cebadores identificados como mtALEC-U y mtALEC-L cuyas secuencias de nucleótidos corresponden a las SEC. ID. NO. 1 (AACCCATTAT ATGTAGACGG A) y SEC. ID. NO. 2 (CTGATCTCTC GTGAGGTGT) respectivamente.