Método para la detección de mutaciones en el gen EGFR en una muestra de sangre de un sujeto,

dicho método comprende:

(i)obtener el ADN de dicha muestra;

(ii)amplificar la secuencia de ácido nucleico correspondiente a una región específica del gen EGFR por medio de PCR usando una sonda de ácido proteíno-nucleico en donde dicha sonda de ácido proteíno-nucleico es capaz de específicamente reconocer e hibridar con la secuencia salvaje de EGFR inhibiendo por tanto su amplificación; y

(iii)detectar dicha mutación

Método para la detección de mutaciones en EGFR en muestras de sangre.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la detección de mutaciones en EGFR en una muestra de sangre (suero/plasma) de un sujeto.

Antecedentes

El cáncer de pulmón es la principal causa de mortalidad por cáncer tanto en hombres como en mujeres. La prevalencia del cáncer de pulmón es segunda sólo respecto a la del cáncer de próstata en hombres y cáncer de mama en mujeres. Recientemente, el cáncer de pulmón ha sobrepasado a las enfermedades cardíacas como la principal causa de mortalidad por tabaquismo. Además, la mayoría de los pacientes que desarrollan cáncer de pulmón fuman y tienen daño por tabaquismo en el corazón y los pulmones, lo que hace de las terapias agresivas quirúrgicas o multimodales opciones menos viables. La mayoría de los carcinomas de pulmón se diagnostican en una fase avanzada, lo que confiere un mal pronóstico.

El cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC, por sus siglas en inglés) representa aproximadamente el 75% de todos los cánceres de pulmón. NSCLC es un agregado heterogéneo de histologías. Las histologías más comunes son carcinoma epidermoide o escamoso, adenocarcinoma y carcinoma de células grandes.

Varios estudios han intentado identificar marcadores clínicos, de laboratorio y moleculares que puedan ayudar a los clínicos e investigadores a distinguir subgrupos de pacientes de NSCLC. De acuerdo con esto, varios estudios han mostrado que el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) se sobreexpresa en el 40 al 80 por ciento de los cánceres de pulmón no microcíticos y muchos otros cánceres epiteliales.

La señalización anormal del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es crítica para limitar la sensibilidad a agentes anticancerosos y la activación independiente de ligando de la tirosina quinasa del EGFR con frecuencia está producida por mutaciones en EGFR en el dominio extracelular, lo que se ha observado en varios tipos de tumores, tal como glioblastoma multiforme. La señalización por EGFR se desencadena mediante la unión de factores de crecimiento, tal como el factor de crecimiento epidérmico (EGF). La autofosforilación y transfosforilación de los receptores a través de sus dominios tirosina quinasa produce el reclutamiento de efectores posteriores y la activación de señales proliferativas y de supervivencia celular.

Dos mutaciones representan aproximadamente el 90% de las mutaciones de EGFR descritas hasta la fecha en adenocarcinomas de pulmón. En la población blanca, el tipo de mutación más común, visto en alrededor del 65% de los casos con mutaciones en EGFR, es una deleción corta que mantiene el marco de lectura de 9, 12, 15, 18 o 24 nucleótidos en el exón 19. La segunda mutación más común, vista en alrededor del 35% de los casos con mutaciones en EGFR, es una mutación puntual (CTG a CGG) en el exón 21 en el nucleótido 2573, que produce la sustitución de leucina por arginina en el codón 858 (L858R) adyacente al motivo DFG en el lóbulo carboxi-terminal en el bucle de activación de la quinasa.

Estas mutaciones en EGFR son auténticas mutaciones somáticas en NSCLC y no se han identificado en otros tipos de tumores primarios. Además, las mutaciones en EGFR son un determinante fuerte de respuesta tumoral a gefitinib en cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC). Se han descrito otras mutaciones mucho menos comunes en los exones 18, 20 y 21.

Hasta ahora, el cribado para estas mutaciones se ha basado en la secuenciación directa o análisis de polimorfismo de conformación de hebra única. Los métodos de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa) permiten la detección de números pequeños de moléculas mutantes entre un fondo de normales. Mientras que medios alternativos para detectar pequeños números de células tumorales (tal como citometría de flujo) en general se han limitado a tumores malignos hematológicos, los ensayos de amplificación de ácidos nucleicos han demostrado tanto sensibilidad como especificidad para identificar células malignas y para predecir el pronóstico después de la quimioterapia.

Se han desarrollado varias estrategias de amplificación de ácidos nucleicos para detectar pequeños números de moléculas mutantes en tejido tumoral sólido. Por ejemplo, un método sensible y específico identifica ADN mutante del oncogén ras basado en el fallo para cortar un sitio de restricción en el 12º codón crucial (Kahn et al. Rapid and sensitive nonradioactive detection of mutant K-ras genes via "enriched" PCR amplification. Oncogene. Junio 1991; 6(6):1079-83). Se pueden aplicar protocolos similares para detectar cualquier región mutada de ADN en una neoplasia, lo que permite la detección de ADN de otros oncogenes o ADN asociado a tumor. Puesto que el ADN mutado se puede detectar no sólo en el cáncer primario sino tanto en lesiones precursoras como en sitios metastásicos, los ensayos de amplificación de ácidos nucleicos proporcionan un medio de detectar y seguir el cáncer tanto pronto como tarde en el curso de la enfermedad.

Otros estudios han usado ensayos de amplificación de ácidos nucleicos para analizar la sangre periférica de pacientes con cáncer para detectar ADN intracelular extraído de células cancerosas circulantes en pacientes. Sin embargo, se debe enfatizar que estos estudios intentan usar ensayos de amplificación basados en ácidos nucleicos para detectar ADN intracelular extraído de células cancerosas circulantes. El ensayo se realiza en la fracción celular de la sangre de pacientes que tienen cáncer usando el precipitado celular o células de la sangre, y la fracción de suero o plasma convencionalmente se ignora o desecha antes del análisis. Puesto que tal planteamiento requiere la presencia de células cancerosas metastásicas circulantes (para tumores no hematológicos), es de uso clínico limitado en pacientes con cánceres tempranos y no es útil en la detección de neoplasias no hematológicas no invasivas o estados pre- cancerosos.

Se sabe en el estado de la técnica que en la sangre de personas sanas circulan cantidades pequeñas pero significativas de ADN normal y se ha encontrado que esta cantidad aumenta en estados cancerosos. El estado de la técnica contiene la divulgación de que el ADN mutante de oncogén se podría detectar en el plasma o suero de sangre periférica de pacientes de cáncer. Sin embargo, en general estos artículos también se han limitado a pacientes con cáncer avanzado o enfermedad neoplásica o proliferativa conocida. Algunos autores (Kimura et al., 2006. EGFR Mutation of Tumor and Serum in Gefitinib-Treated Patients with Chemotherapy-Naive Non-small Cell Lung Cancer) han descrito que se pueden detectar mutaciones en el gen EGFR en muestras de suero de pacientes que padecen NSCLC. Dicho documento describe la detección de tales mutaciones por medio de PCR y secuenciación usando cebadores que flanquean dichas mutaciones.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere a un método para la detección de mutaciones en el gen EGFR en una muestra de sangre de un sujeto, dicho método comprende:

Aquí, los inventores han desarrollado y validado un ensayo basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de las mutaciones más comunes de EGFR en muestras de suero/plasma. Este ensayo ofrece mayor sensibilidad analítica al aumentar la amplificación de alelos mutantes en la muestra a ser analizada mediante el uso de una sonda de ácido proteíno-nucleico (APN) comparado con métodos estándar, en los que se usan cebadores que flanquean las mutaciones para la amplificación por PCR y análisis de secuenciación posterior. De esta manera, aquí se proporciona un planteamiento consistente y accesible para la identificación rápida de la mayoría de los pacientes de cáncer de pulmón que es probable que respondan a inhibidores específicos de EGFR.

Además, mientras que el análisis...

1. Método para la detección de mutaciones en el gen EGFR en una muestra de sangre de un sujeto, dicho método comprende:

2. Método según la reivindicación 1, en donde la mutación en el gen EGFR a ser detectada se selecciona del grupo que consiste en: deleciones ELREA en el exón 19, la mutación L858R en el exón 21 y la mutación T790M.

3. Método según la reivindicación 1, en donde dicha muestra de sangre es una muestra de suero o plasma.

4. Método según la reivindicación 1, en donde el paso de detección se lleva a cabo por medio de secuenciación de ácido nucleico.

5. Método según la reivindicación 1, en donde el paso de detección se lleva a cabo por medio de tecnología GeneScan.

6. Método según la reivindicación 5, en donde dicha tecnología GeneScan comprende usar un cebador oligonucleotídico que está fluorescentemente marcado en su extremo 5' con un colorante fluorescente.

7. El método de la reivindicación 6, en donde dicho colorante fluorescente se selecciona del grupo que consiste en colorantes 6-FAM, HEX o NED.