PROCEDIMIENTO PARA LA CARACTERIZACION DE CELULAS CANCEROSAS DISEMINADAS Y MICROMETASTATIZADAS.

Procedimiento para la caracterización de células cancerosas diseminadas y micrometastatizadas mediante análisis de ácidos nucleicos en el que

i) las células obtenidas a partir del fluido corporal de un individuo se investigan para por lo menos un ARNm de un primer gen específico para cáncer;

y

ii) las células cancerosas separadas a partir del fluido corporal de un individuo se investigan para por lo menos un ADN o ARNm de un segundo gen específico para cáncer o asociado a cáncer y la misma investigación se realiza con células no cancerosas del mismo individuo para la comparación,

siendo distintos el primer y el segundo gen

Procedimiento para la caracterización de células cancerosas diseminadas y micrometastatizadas.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la caracterización de células cancerosas diseminadas y micrometastatizadas mediante análisis de ácidos nucleicos y al uso de este procedimiento para el diagnóstico in vitro de cáncer y para otros fines.

El diagnóstico del cáncer en el ser humano representa al igual que antes uno de los mayores desafíos de la medicina actual. Los procedimientos de diagnóstico corrientes permiten el reconocimiento de tumores de tipo canceroso que a continuación deberán denominarse en conjunto tumores (sarcomas, carcinomas, neoplasias sistémicas hematológicas), frecuentemente sólo cuando el tumor ya ha alcanzado un estadio avanzado. A pesar de los considerables avances en los procedimientos de obtención de imágenes, a su aplicación satisfactoria siempre se le supone un cierto tamaño mínimo del tumor. Además, con los procedimientos de este tipo, dado el caso, sólo se obtiene muy poca información secundaria sobre el tipo y la constitución del tumor. Por tanto, los procedimientos de obtención de imágenes que requieren mucho tiempo y de costes extremadamente altos sólo sirven generalmente como ayudas para la orientación para el otro procedimiento, frecuentemente directo, generalmente una extracción de tejido. Pero esta última medida significa una intervención invasiva en el cuerpo del paciente que, dependiendo de la localización y constitución del tumor, puede ser muy desagradable e incluso peligrosa para el paciente.

Si mediante una extracción de tejido tal se identifica un tumor, normalmente siguen otras investigaciones que deberán describir, por ejemplo, el potencial de diseminación, es decir, la formación de metástasis de este tumor.

Si se diagnostica, por ejemplo, cáncer de mama, de la paciente afectada se extirpan generalmente de 20 a 30 ganglios linfáticos y se determina el número de ganglios linfáticos que presentan células cancerosas. La opinión prevaleciente se basa en que la posibilidad de supervivencia de una paciente disminuye al aumentar el número de ganglios linfáticos afectados. No obstante, los hallazgos más recientes indican que la aparición de tales metástasis de los ganglios linfáticos es más bien una medida de la edad que de la malignidad o el potencial de metastatización del tumor.

Como consecuencia del desarrollo avanzado de procedimientos de biología molecular y el creciente conocimiento sobre las bases genéticas de la degeneración celular, en los últimos años se han abierto nuevos caminos para diagnosticar cáncer. Se partió de que las células cancerosas expresan marcadores característicos debido a los cuales deberán diferenciarse de células no degeneradas y así identificarse como células cancerosas. Con el desarrollo de la técnica del hibridoma y el cultivo así hecho posible de anticuerpos monoclonales se diseñó una pluralidad de inmunoensayos que deberán contribuir al diagnóstico del cáncer mediante la detección de determinados marcadores. Ejemplos de tales marcadores son el antígeno carcinoembrionario (CEA), la a-fetoproteína (AFP) o el antígeno prostático específico (PSA). En el documento EP 0 747 705 se propuso recientemente investigar sólo la glicoforma de 90 kDa de un grupo estructuralmente asociado a CEA de proteínas (NCA) en la sangre ya que aparentemente sólo esta glicoforma se libera al torrente sanguíneo. El documento WO 96/21862 especifica que la medición de la concentración de A-proteína en la sangre permitiría el diagnóstico de cáncer, pero también establece que las esperanzas depositadas en los marcadores investigados hasta la fecha, como CEA, AFP o PSA, no se han cumplido. Otros procedimientos basados en la detección inmunológica de determinadas proteínas se describen, por ejemplo, en los documentos DE 195 00 723; WO 97/26271; WO 97/28186; WO 96/01907; US 5.633.142; US 5.620.848; US 5.589.579; y US 5.563.247. No obstante, un diagnóstico fiable de cáncer no parece ser posible de esta forma al menos en este momento.

Por el contrario, otros equipos de investigadores se han concentrado en el análisis del material genético de células cancerosas. Así, el documento WO 93/04200 propone para estimar una predisposición para cáncer de mama aislar ADN de una muestra de sangre de la paciente, restringir este ADN de determinada forma y, debido al patrón de restricción, hacer un diagnóstico correspondiente. No obstante, con este procedimiento no es posible una detección de células tumorales en la sangre.

El documento WO 96/02671 describe además un procedimiento con el que se investiga ADN genómico o ADNc de tejido neoplásico, sangre u otro fluido corporal solo mediante análisis de secuencias (secuenciación o hibridación) para mutaciones de un gen que codifica una proteína cuya alteración de la función está relacionada con cáncer. En los documentos WO 97/26271; WO 97/28186; WO 96/15262; WO 96/01907; WO 93/22456; US 5.620.848; US 5.149.628 y WO 96/21021 se informa de enfoques similares.

También se ha propuesto reiteradamente investigar el ADN y/o ARN presente libre en el plasma sanguíneo para mutaciones o deleciones oncógenas, mutaciones o deleciones de genes supresores de tumores o modificaciones del patrón de microsatélites (véanse, por ejemplo, los documentos WO 95/16792; DE 37 21 400; DE 37 17 212; y WO 93/22456).

Finalmente, el documento WO 94/10343 también describe un procedimiento para el diagnóstico de cáncer, concretamente para reconocer micrometástasis de cáncer de próstata investigando el ARN de la sangre de un paciente que codifica el antígeno prostático específico. No obstante, en este procedimiento se obtienen en aproximadamente dos tercios de los casos las denominadas respuestas positivas falsas ya que las inflamaciones o lesiones de la próstata también aumentan la concentración de la proteína en la sangre. Por otra parte, debido a las insuficiencias de la prueba, supuestamente el 30% de las enfermedades cancerosas quedan sin detectar al igual que antes. En el documento US 5.601.990 se elige una manera de proceder similar para el diagnóstico de cáncer de intestino metastatizante. El documento WO 96/35808 se ocupa de la detección de una proteína (hCRG). El documento WO 96/17080 describe la detección de tumores y/o su metastatización mediante la detección de CK20. El procedimiento descrito en Noguchi, S. y col., Cancer, tomo 74, nº 5, 1994, páginas 1595-1600, se basa en la amplificación de ARNm de MUC1. Pittman, K. y col., Annals of Oncology, tomo 7, 1996, páginas 297-301 y van der Velde-Zimmermann, D. y col., American Journal of Pathology, tomo 149, nº 3, 1996, páginas 759-764, recurren al ARNm de tirosinasa para la detección de las células de melanoma en circulación. En Burchill, S. A. y col., British Journal of Cancer, tomo 71, 1995, páginas 278-281, se expone que el ARNm de CK20 podría servir posiblemente para la detección de células tumorales metastatizadas de origen epitelial, mientras que CK8 y CK19 no serían adecuadas para esto. El documento WO 97/07242 trata procedimientos inmunológicos y el documento WO 97/07242 describe una RT-PCR en PSA.

En Pantel, K. y Rietmüller, G., Onkologie, tomo 18, 1995, páginas 394-401, se toman cartas en los análisis de PCR específicos para mutaciones (Ki-ras y p53), así como en los planteamientos de RT-PCR para la detección de los denominados antígenos específicos para tejidos (CK19, CEA, PSA, PSM). Mientras que los análisis específicos para mutaciones se aplican a tumores primarios, los análisis de RT-PCR también deberán utilizarse en muestras de sangre. No obstante, cada uno de los marcadores de ARNm específicos para epitelio considerados se trata por sí mismo y sin referencia a otros. Jung, R. y col., European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry, tomo 35, nº 1, 1997, páginas 3-10, tratan distintos trabajos originales que se basan respectivamente en análisis de RT-PCR individuales. Schmitz-Dräger, B. J. y col., World Journal of Urology, tomo 14,1996, páginas 190-196, agrupan distintos planteamientos de otros grupos de trabajo que analizan tumores primarios y de éstos derivan factores relevantes para la metastatización.

El documento WO 96/29430 describe un procedimiento denominado "ensayo de marcadores múltiples" ("Multiple Marker Assay") para detectar metástasis de melanoma o de cáncer de mama con el que se investiga más de 1 parámetro. Además, no obstante se utiliza exclusivamente la metodología de RT-PCR para la detección de ARNm que normalmente no están presentes en el fluido corporal investigado. Así, por ejemplo,...

1. Procedimiento para la caracterización de células cancerosas diseminadas y micrometastatizadas mediante análisis de ácidos nucleicos en el que

        i)        las células obtenidas a partir del fluido corporal de un individuo se investigan para por lo menos un ARNm de un primer gen específico para cáncer; y

        ii)        las células cancerosas separadas a partir del fluido corporal de un individuo se investigan para por lo menos un ADN o ARNm de un segundo gen específico para cáncer o asociado a cáncer y la misma investigación se realiza con células no cancerosas del mismo individuo para la comparación,

siendo distintos el primer y el segundo gen.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el fluido corporal es sangre o médula ósea.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque las células obtenidas a partir del fluido corporal del individuo pueden obtenerse obteniendo células, un concentrado que contiene células o un líquido que contiene células del fluido corporal.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque las células, el concentrado que contiene células o el líquido que contiene células es una fracción de sangre que comprende células mononucleares.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque las células cancerosas separadas a partir del fluido corporal de un individuo pueden obtenerse separando células cancerosas del fluido corporal o de fracciones que contienen células del mismo mediante inmunoadsorción, microfiltración o centrifugación en gradiente de densidad.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la investigación de las células obtenidas a partir del fluido corporal del individuo para por lo menos un ARNm de un primer gen específico para cáncer incluye un análisis de expresión de ARNm, no expresándose esencialmente el gen de células no cancerosas del fluido corporal investigado.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque el ARNm es un ARNm expresado por el gen CEA, CK20, MUC1, tirosinasa o MAGE3.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la investigación de las células cancerosas separadas a partir del fluido corporal del individuo para por lo menos un ADN o ARNm de un segundo gen específico para cáncer o asociado a cáncer incluye una investigación para mutaciones, amplificaciones, LOH, translocaciones o polimorfismos de ADN genómico.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque el ADN genómico es un ADN genómico del gen p53, erb-B2, c-myc, K-ras, RB, APC o DCC.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la investigación de las células cancerosas separadas a partir del fluido corporal del individuo para por lo menos un ADN o ARNm de un segundo gen específico para cáncer o asociado a cáncer incluye una investigación para una expresión del gen modulada en comparación con células no cancerosas del fluido corporal del mismo individuo.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque se expresa el gen de células no cancerosas del fluido corporal del mismo individuo.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el gen asociado a cáncer es un gen específico para tejidos, gen asociado a metastatización, gen de receptores de hormonas esteroideas, gen de quimiorresistencia o gen que guarda relación con la inmunomodulación, proliferación celular o apoptosis.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque el gen asociado a metastatización codifica un factor de angiogénesis, factor de motilidad, factor de crecimiento, factor de degradación de la matriz o factor de adhesión.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque el ARNm es ARNm expresado por el gen bFGF, bFGF-R, VEGF, VEGF-R1, VEGF-R2 MMP2 o TIMP3.

15. Uso del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14 para el diagnóstico in vitro de cáncer.

16. Uso del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14 para la detección de células cancerosas diseminadas y micrometastatizadas.

17. Uso del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14 para la localización de órganos de la fuente de diseminación de células cancerosas diseminadas y micrometastatizadas o para la creación de un perfil de riesgo de células cancerosas diseminadas y micrometastatizadas.