INMUNOADHESINA PARA LA PREVENCION DE LA INFECCION POR RINOVIRUS.

Inmunoadhesina que comprende una molécula quimérica ICAM-1, comprendiendo dicha molécula quimérica ICAM-1 una proteína del receptor de rinovirus unida a al menos una porción de una cadena pesada de inmunoglobulina;

en la que dicha porción de dicha cadena pesada de inmunoglobulina permite a dicha cadena pesada unirse a una cadena J; y una cadena J y un componente secretor, en la que dicha cadena J y el componente secretor se asocian con dicha molécula quimérica ICAM-1; y en la que dicha inmunoadhesina se expresa en una planta o célula de planta y se glicosila en la anterior

Inmunoadhesina para la prevención de la infección por rinovirus.

Prioridad

Esta solicitud reivindica el beneficio bajo el artículo 119(e) de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos Nº 60/200.298, presentada el 28 de abril de 2000, titulada NOVEL IMMUNOADHESIN FOR THE PREVENTION OF RHINOVIRUS INFECTION, y que designa como inventores a J. W. Larrick y K. L. Wycoff.

Declaración respecto a investigación o desarrollo financiados con fondos federales

Se proporcionó financiación federal a la investigación en forma de una beca SBIR Fase I (R43 AI43122) y una beca SBIR Fase II (2R44AI43122-02).

Campo de la invención

La presente invención se refiere a inmunoadhesinas, fusiones de la proteína del receptor del rinovirus humano e inmunoglobulina, y la expresión de inmunoadhesinas en plantas. También se contempla el uso terapéutico de las inmunoadhesinas para la prevención y tratamiento de la infección por rinovirus.

Antecedentes de la invención

El resfriado común es por lo general una enfermedad relativamente leve, sin embargo, son habituales complicaciones significativas derivadas de los resfriados, tales como otitis media, sinusitis y agravamiento del asma. Los rinovirus humanos (RVH) producen hasta un 50% de todos los resfriados en adultos y un 25% de los resfriados en niños (Bella y Rossmann, J Struct Biol. 128:69-74, 1999, y Sperber y Hayden, Antimicrob Agents Chemother. 32:409-19, 1988). El coste para la sociedad es de miles de millones de dólares anuales. Estos pequeños virus de ARN no evolucionados representan un subgrupo del picornavirus (Rueckert, Virology, pp. 507-548, eds. Fields, y col., Raven Press, Ltd. Nueva York, 1990). La cristalografía mediante rayos x del rinovirus identificó una cápsida de 300 Å de diámetro (1 Å = 0,1 nm) con simetría icosaédrica, construida a partir de dieciséis copias de cada una de las proteínas de recubrimiento VP1, VP2, y VP3 (Rossmann, Nature 317:145-153, 1985). Se ha sugerido que una depresión superficial o "cañón" en el RVH es el emplazamiento de unión del receptor (Colonno, y col., Proc Natl Acad Sci USA. 85:5449-5453, 1985; Rossmann, y col. Nature 317:145-153, 1985). De los 102 serotipos caracterizados de RVH, 91 (conocido como grupo principal) comparten como receptor una glicoproteína de la superficie celular conocida como molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) (Greve, y col., Cell 56:839-847, 1989; Staunton, y col., Cell 56:849-853, 1989); el emplazamiento de unión se ubica dentro de la región N-terminal 1 (Greve, y col., J Virol. 65:6015-6023, 1991; Staunton, y col., Cell 61:243-254, 1990).

ICAM-1 es una proteína de membrana con cinco regiones extracelulares, una región transmembrana hidrófoba, y una corta región citoplásmica. ICAM-1 se expresa en muchas células importantes en las respuestas inmunes e inflamatorias, y se puede inducir en otras (Casasnovas, y col., Proc Natl Acad Sci USA. 95:4134-9, 1998). ICAM-1 funciona como ligando de las integrinas leucocitarias LFA-1 y Mac-1 (Springer, Cell. 76:301-14, 1994; Staunton y col., Cell 61:243-254, 1990). En la superficie celular, ICAM-1 es principalmente un dímero debido a la asociación de las regiones transmembrana (Miller, y col., J Exp Med. 182:1231-41, 1995; Reilly, y col. J Immunol. 155:529-32, 1995).

Se demostró que las formas recombinantes solubles de ICAM-1 (sICAM-1) constituidas por las cinco regiones extracelulares eran eficaces para bloquear la infección por rinovirus de células humanas in vitro (Greve, y col., J Virol. 65:6015-6023, 1991; Marlin, y col., Nature. 344:70-2, 1990). La evaluación de la actividad de sICAM-1 frente a un conjunto de cepas de laboratorio y aislados de campo demostró que todas las cepas principales de RVH son sensibles a sICAM-1. Las cepas secundarias, que no usan ICAM como receptor, no resultaron afectadas por sICAM-1 (Crump y col., Antiviral Chem Chemother. 4:323-327, 1993; Ohlin, y col., Antimicrob Agents Chemother. 38:1413-5, 1994).

La actividad antivírica de la ICAM-1 soluble in vitro parece estar mediada por más de un mecanismo. Estos mecanismos incluyen la competición con las células ICAM-1 superficiales por los emplazamientos de unión, interferencia con la entrada o no revestimiento de virus, e inactivación directa por liberación prematura del ARN vírico y la formación de cápsidas vacías (Arruda, y col., Antimicrob Agents Chemother. 36:1186-1191, 1992; Greve, y col., J Virol. 65:6015-6023, 1991; Marlin, y col., Nature 344:70-2, 1990; Martin y col., J Virol. 67:3561-8,1993).

El conjunto de huéspedes del RVH está restringido a los primates. Un reciente estudio demostró que la ICAM-1 soluble era eficaz en la prevención de la infección por rinovirus en chimpancés (Huguenel, y col., Am J Respir Crit Care Med. 155:1206-10, 1997). Aunque los chimpancés no muestran síntomas clínicos, la infección se demuestra midiendo la seroconversión y propagación de virus. Una única dosis de 10 mg de ICAM-1 soluble como pulverización intranasal fue eficaz y evitó la infección por RVH-16 cuando se administró conjuntamente con RVH, o cuando el virus se administró diez minutos después.

El documento WO 01/64929 se refiere a composiciones y procedimientos para la transformación de plástidos de células de plantas con múltiples genes y asociación o ensamblaje adecuado de proteínas multiméricas que son heterólogas respecto de los plástidos de células de plantas. Se usa una construcción de plásmido que codifica todos los componentes individuales de polipéptido de las proteínas multiméricas. Las cadenas ligera y pesada de la inmunoglobulina se ensamblan en inmunoglobulinas activas no glicosiladas en el cloroplasto.

Un ensayo clínico con ICAM-1 soluble demostró que ésta reducía la gravedad de resfriados experimentales por RVH (Turner, y col., JAMA 281: 1797-804,1999). En este ensayo, un total de 196 sujetos recibieron bien ICAM-1 soluble o bien placebo en diferentes formulaciones. Se proporcionó a algunos sujetos ICAM-1 soluble o placebo siete horas antes de la inoculación con RVH 39 y otros iniciaron tratamiento doce horas después de la inoculación del virus. Los medicamentos se administraron en forma tanto de disolución intranasal o en polvo, administrados en seis dosis diarias durante siete días (un total de 4,4 mg por día). En este estudio, la ICAM-1 soluble no previno la infección, medida tanto por aislamiento del virus o seroconversión (tasa de infección del 92% para tratados con placebo vs. 85% de los tratados con ICAM-1 soluble). Sin embargo, la ICAM-1 soluble tuvo influencia sobre todas las medidas de la enfermedad. La puntuación total de síntomas se redujo en un 45%, la proporción de sujetos con resfriado clínico se redujo en un 23% y el peso de moco nasal se redujo en un 56%. No hubo diferencias significativas entre el uso de formulaciones en polvo o en disolución, o entre los grupos preinoculados o postinoculados. El tratamiento con ICAM-1 soluble no dio como resultado ningún efecto secundario o evidencia de absorción a través de la mucosa nasal. Igualmente, no hubo inhibición del desarrollo de anticuerpos de tipo específico anti-RVH.

Según se ha descrito, ICAM-1 es dimérica en la superficie celular. Martin y col., en J Virol. 67:3561-8, (1993) propusieron por vez primera que la unión multivalente entre RVH y una ICAM multimérica soluble daría por resultado una mayor afinidad eficaz, denominada avidez, y así facilitar el no recubrimiento del virus. Construyeron moléculas multivalentes ICAM-1/inmunoglobulina, postulando que éstas serían más eficaces que la ICAM-1 soluble monovalente en la neutralización de RVH y de esta forma tendrían una mayor eficacia terapéutica. Estas moléculas ICAM-1/inmunoglobulina indujeron regiones 1 y 2 aminoterminales en ICAM-1 fusionadas con las regiones bisagra y constante de las cadenas pesadas de IgA1 (IC1-2D/IgA), IgM (IC1-2D/IgM) e IgG1 (IC1-2D/IgG). Además, se fusionaron cinco regiones extracelulares con IgA1 (IC1-5D/IgA). Estas moléculas ICAM-1/inmunoglobulina se compararon con las formas soluble de la ICAM-1 que tenían dos (sIC1-2D) y cinco (sIC1-5D) regiones en ensayos de unión a RVH, ineficacia y conformación. La inmunoglobulina ICAM-1/IgA (IC1-5D/IgA) resultó 200 veces, y las moléculas inmunoglobulina ICAM-1/IgM (IC1-2D/IgM) e inmunoglobulina ICAM-1/IgG (IC1-2D/IgG) resultaron 25 y 10 veces más eficaces que la ICAM-1 soluble. Estas moléculas fueron muy eficaces en la inhibición de la unión del rinovirus a las células y perturbando la conformación de la cápsida del virus. Las moléculas de inmunoglobulina ICAM-1/IgA fueron eficaces en el intervalo de concentración...

1. Inmunoadhesina que comprende una molécula quimérica ICAM-1, comprendiendo dicha molécula quimérica ICAM-1 una proteína del receptor de rinovirus unida a al menos una porción de una cadena pesada de inmunoglobulina; en la que dicha porción de dicha cadena pesada de inmunoglobulina permite a dicha cadena pesada unirse a una cadena J; y una cadena J y un componente secretor, en la que dicha cadena J y el componente secretor se asocian con dicha molécula quimérica ICAM-1; y en la que dicha inmunoadhesina se expresa en una planta o célula de planta y se glicosila en la anterior.

2. Inmunoadhesina de la reivindicación 1 en la que dicha proteína del receptor de rinovirus está comprendida por cualquier combinación de las regiones extracelulares 1, 2, 3, 4 y 5 de ICAM-1.

3. Inmunoadhesina de la reivindicación 1 en la que dicha inmunoglobulina se selecciona entre el grupo de IgA, IgA1, IgA2, IgM, y las cadenas pesadas de la inmunoglobulina quimérica.

4. Inmunoadhesina de la reivindicación 1 que comprende además al menos una molécula quimérica ICAM-1 adicional.

5. Inmunoadhesina de la reivindicación 1 en la que dicha proteína del receptor de rinovirus está comprendida por cualquier combinación de las regiones extracelulares 1, 2, 3, 4 y 5 de ICAM-1; y dicha cadena pesada de inmunoglobulina es una porción de una cadena pesada de IgA₂.

6. Inmunoadhesina de la reivindicación 1 expresada en plantas transgénicas.

7. Inmunoadhesina de la reivindicación 1 expresada en plantas monocotiledóneas.

8. Inmunoadhesina de la reivindicación 1 expresada en plantas dicotiledóneas.

9. Inmunoadhesina de la reivindicación 1 en la que todas las proteínas son humanas.

10. Inmunoadhesina de la reivindicación 1 expresada en cultivos con raíces en cabellera.

11. Inmunoadhesina de la reivindicación 1 expresada en células de plantas en cultivo de tejidos.

12. Inmunoadhesina que comprende una molécula quimérica ICAM-1, comprendiendo dicha molécula quimérica ICAM-1; una proteína del receptor de rinovirus unida a al menos una porción de una cadena pesada de inmunoglobulina, en la que dicha inmunoadhesina se produce o expresa en una planta o célula de planta y se glicosila en la anterior y en la que dicha porción de dicha cadena pesada de inmunoglobulina confiere función efectora de anticuerpo.

13. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 en la que dicha inmunoadhesina comprende además una cadena J y un componente secretor asociados con dicha molécula quimérica ICAM-1.

14. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 en la que dicha proteína del receptor de rinovirus está comprendida por cualquier combinación de las regiones extracelulares 1, 2, 3, 4 y 5 de ICAM-1.

15. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 en la que dicha cadena pesada de inmunoglobulina se selecciona entre el grupo de IgA, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgD, IgE, y la cadena pesada de la inmunoglobulina quimérica.

16. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 que comprende además al menos una molécula quimérica ICAM-1 adicional.

17. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 en la que dicha proteína del receptor de rinovirus está comprendida por cualquier combinación de las regiones extracelulares 1, 2, 3, 4 y 5 de ICAM-1; y dicha cadena pesada de inmunoglobulina comprende al menos una porción de la cadena pesada de IgA₂.

18. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 en la que todas las proteínas son humanas.

19. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 expresada en células heterólogas derivadas de plantas.

20. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 expresada en cultivos con raíces en cabellera.

21. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 expresadas en células de plantas en cultivos de tejidos.

22. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 expresada en plantas monocotiledóneas.

23. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 expresada en plantas dicotiledóneas.

24. Composición que comprende una inmunoadhesina y material de la planta, en la que dicha inmunoadhesina se expresa en una planta y se glicosila en la anterior y comprende una molécula quimérica ICAM-1, comprendiendo dicha molécula quimérica ICAM-1 una proteína del receptor de rinovirus unida a al menos una porción de una cadena pesada de inmunoglobulina, en la que dicha porción de dicha cadena pesada de inmunoglobulina confiere función efectora de anticuerpo.

25. Composición de la reivindicación 24 que comprende además una cadena J y un componente secretor asociados con dicha molécula ICAM-1 quimérica.

26. Composición de la reivindicación 24 en la que dicha proteína del receptor de rinovirus está comprendida por cualquier combinación de las regiones extracelulares 1, 2, 3, 4 y 5 de ICAM-1.

27. Composición de la reivindicación 24 en la que dicha inmunoglobulina se selecciona entre el grupo de IgA, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgD, IgE, y una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica.

28. Composición de la reivindicación 24 que comprende además una molécula quimérica ICAM-1 adicional.

29. Composición de la reivindicación 24, en la que dicha proteína del receptor de rinovirus está comprendida por cualquier combinación de las regiones extracelulares 1, 2, 3, 4 y 5 de ICAM-1; y dicha cadena pesada de inmunoglobulina es una cadena pesada de IgA₂.

30. Procedimiento in vitro para reducir la infección por rinovirus humano en células huéspedes susceptibles a la infección por rinovirus humano, comprendiendo dicho procedimiento: poner en contacto el virus con una inmunoadhesina de la reivindicación 1, 12, ó 24, y en el que dicha inmunoadhesina, se une al rinovirus humano y reduce la infectividad del mismo.

31. Inmunoadhesina de la reivindicación 1, 12 ó 24 para reducir el inicio de la diseminación del resfriado común debido a rinovirus humano.

32. Inmunoadhesina de la reivindicación 1, 12 ó 24 para el tratamiento o la prevención de la infección por rinovirus humano en un sujeto humano.

33. Inmunoadhesina de la reivindicación 1, 12 ó 24 para el tratamiento o la prevención de la infección por rinovirus humano en un sujeto, en un procedimiento que comprende administrar intranasalmente a dicho sujeto una cantidad eficaz de dicha inmunoadhesina.

34. Inmunoadhesina de la reivindicación 1, 12 ó 24 para el tratamiento o la prevención de una infección por rinovirus humano en un sujeto, en un procedimiento que comprende administrar a través de la cavidad oral a dicho sujeto una cantidad eficaz de dicha inmunoadhesina.

35. Composición farmacéutica que comprende una inmunoadhesina de la reivindicación 1, 12, ó 24 en un tampón farmacéuticamente aceptable.

36. Vector de expresión que comprende un gen que codifica una inmunoadhesina que comprende una molécula quimérica ICAM-1 unida operativamente a un promotor de la planta, dicha inmunoadhesina se expresa en una planta y se glicosila en la anterior y dichas moléculas quiméricas ICAM-1 comprenden una proteína del receptor de rinovirus unida a al menos una porción de una cadena pesada de inmunoglobulina, en la que dicha porción de dicha cadena pesada de inmunoglobulina confiere función efectora de anticuerpo.