Un método de expresar una glicosiltransferasa y una glicoproteína exógena que tienen una cadena de azúcar de tipo humano en una célula de planta transformada,

que comprende un paso en el que se obtiene una célula de planta transformada por introducción en una célula de planta del gen de una glicosiltransferasa y el gen de una glicoproteína exógena, y un paso en el cual se cultiva la célula de planta transformada obtenida

Método para fabricación de glicoproteínas que tienen glicosilación de tipo humano.

Campo técnico

La presente invención se refiere a la expresión de glicoproteínas exógenas por las plantas.

Técnica anterior

Muchas de las proteínas funcionales en los organismos vivos son glicoproteínas. Ha quedado esclarecido que la diversidad de las cadenas de azúcar en las glicoproteínas juega varios papeles fisiológicamente importantes (Lain, R.A., Glycobiology, 4, 759-767, 1994).

En los últimos años, ha quedado claro también que la acción de las cadenas de azúcar puede dividirse en dos categorías. En el primer caso, las cadenas de azúcar tienen una función directa como ligandos para la unión de células, o como receptores para bacterias y virus, en el aclaramiento de las glicoproteínas de la sangre, el direccionamiento a los lisosomas de enzimas lisosómicas y el direccionamiento por las glicoproteínas hacia tejidos y órganos específicos. Por ejemplo, se ha demostrado la contribución de las cadenas de azúcar de las glicoproteínas en la infección de las células diana por el virus del SIDA (HIV) (Rahebi, L. et al., Glycoconj. J., 12, 7-16, 1995). La superficie del HIV está cubierta con la proteína de la envoltura gp120. La fijación de las cadenas de azúcar gp120 al CD4 de las células diana es el comienzo de la infección por el virus HIV. En el segundo caso, la cadena de azúcar propiamente dicha no es la molécula funcional pero contribuye indirectamente a la formación de la estructura de orden superior de las proteínas, solubilidad de las proteínas, resistencia de las proteínas a las proteasas, inhibición de la antigenicidad, modificación de la función de las proteínas, ajuste de la tasa de regeneración de las proteínas, y ajuste de la cantidad de proteínas expresada en capas de células. Por ejemplo, las cadenas de azúcar son instrumentales en el ajuste de la adhesión de las moléculas de adhesión de las células nerviosas que están distribuidas ampliamente en el sistema nervioso (Edelman, G.M., Ann. Rev. Biochem., 54, 135-169, 1985).

En los eucariotas, las cadenas de azúcar de las glicoproteínas se sintetizan en los lípidos del retículo endoplasmático como cadenas de azúcar precursoras. La porción de la cadena de azúcar se transfiere a la proteína, y a continuación algunos de los residuos de azúcar en la proteína son eliminados en el retículo endoplasmático, después de lo cual la glicoproteína se transporta a los cuerpos de Golgi. En los cuerpos de Golgi, después que se han eliminado los residuos excesivos de azúcar, se añaden residuos de azúcar ulteriores (v.g. manosa) y se extiende la cadena de azúcar (Narimatsu, H., Microbiol. Immunol., 38, 489-504, 1994).

Más específicamente, por ejemplo, se transfiere Glc3Man9GlcNAc2 sobre anclas de dolichol a la proteína en la membrana del ER (Moremen K.W., Trimble, R.B. and Herscovics A., Glycobiology 1994 Apr;4(2):113-25, Glycosidases of the asparagine-linked oligosaccharide processing pathway; y Sturm, A. 1995 N-Glycosylation of plant proteins. En: New Comprehensive Biochemistry. Glycoproteins, Vol.29a., Montreuil, J., Schachter, H. y Vliegenthart, J.F.G.(eds). Elsevier Science Publishers B.V., Países Bajos, pp. 521-541). ER-glucosidase I and II removes three glucose units (Sturm, A. 1995, supra; y Kaushal G.P. y Elbein A.D., 1989, Glycoprotein processing enzymes in plants. En Methods Enzymology 179, Complex Carbohydrates Part F. Ginsburg V. (ed), Academic Press, Inc. NY, pp.452-475). La estructura rica en manosa resultante (Man9GlcNAc2) es ajustada por ER-manosidasa (Moremen K.W. et al, supra; y Kornfeld, R. y Kornfeld, S., Annu. Rev. Biochem., 54, 631-664, 1985; Assembly of asparagine-linked oligosaccharides). El número de residuos manosa eliminados varía de acuerdo con las diferencias en la accesibilidad a las enzimas de procesamiento. Los isómeros Man8-, Man7-, Man6- y Man5GlcNAc2 se producen durante el procesamiento por la manosidasa del ER y la manosidasa I (Kornfeld, R. y Kornfeld, S., supra). Cuando se eliminan completamente 4 residuos manosa por la manosidasa I (Man I), el producto es Man5GlcNAc2. La N-acetilglucosaminil-transferasa I (GlcNAc I) transfiere N-acetilglucosamina (GlcNAc) desde UDP-GlcNAc a Man5GlcNAc2, dando como resultado GlcNAcMan5GlcNAc2 (Schachter, H., Narasimhan, S., Gleeson, P., y Vella, G., Glycosyltransferases involved in elongation of N-glycosidically linked oligosaccharides of the complex or N-acetylgalactosamine type. En: Methods Enzymol 98: Biomembranes Part L. Fleischer, S., y Fleischer, B. (ed), Academic Press, Inc. NY, pp.98-134 pp. 98-134, 1983). La manosidasa II (Man II) elimina dos residuos manosa de GlcNAcMan5GlcNAc2, produciendo GlcNAcMan3GlcNAc2 (Kaushal, G.P. y Elbein, A.D., supra; y Kornfeld, R. y Kornfeld, S., supra). El oligosacárido GlcNAcMan4GlcNAc2 se utiliza como sustrato de la N-acetilglucosaminil-transferasa II (GlcNAc II) (Moremen K.W. et al, supra; Kaushal, G.P. y Elbein, A.D., supra; y Kornfeld, R. y Kornfeld, S., supra). Fig 19 resume las estructuras arriba descritas de glucanos unidos por N y enzimas implicadas en el camino de modificación de las cadenas azúcar en el retículo endoplasmático y los cuerpos de Golgi. En Fig 19, Diamond denota glucosa. boxempty denota GlcNAc, medcirc denota manosa, medbullet denota galactosa, y - denota ácido esteárico, respectivamente.

La adición de azúcar en los cuerpos de Golgi se denomina síntesis terminal de las cadenas de azúcar. El proceso difiere ampliamente entre los organismos vivos. La síntesis de las cadenas de azúcar depende del tipo de eucariota. La estructura de las cadenas de azúcar resultante es específica de la especie, y refleja la evolución de la transferasa de adición de azúcar y los cuerpos de Golgi (Narimatsu, H., Cellular Biology, 15, 802-810, 1996).

En relación con las cadenas de azúcar analizadas por asparagina (unidas por N); en los animales, existen cadenas de azúcar de tipo rico en manosa, cadenas de azúcar de tipo complejo y cadenas de azúcar de tipo híbrido. Estas estructuras se muestran en Fig 1. Las cadenas de azúcar de tipo complejo en las plantas tienen α-1.3 fucosa y β-1.2-xilosa, que son residuos azúcar que no se encuentran en los animales (Johnson, K.D. y Chrispeels, M.J., Plant Physiol., 84, 1301-1308, 1897, Kimura, Y. et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56, 215-222, 1992). En el caso de las cadenas de azúcar unidas por N, se ha encontrado ácido siálico en las cadenas de azúcar animales, pero no se ha encontrado en las cadenas de azúcar de las plantas. En lo que respecta a la galactosa, que se encuentra generalmente en las cadenas de azúcar de los animales, aunque la presencia de las mismas se ha encontrado en algunas cadenas de azúcar de plantas (Takahashi, N. y Hotta, T., Biochemistry, 25, 388-395, 1986), los ejemplos de esto son pocos. El tipo de enlace de las mismas es un enlace β-1,3 (FEBS Lett 1997 Sep 29, 415(2), 186-191, Identification of the human Lewis(a) carbohydrate motif in a secretory peroxidase from a plant cell suspension culture (Vaccinium mytillus L.), Melo NS, Nimtz M, Contradt HS, Fevereiro PS, Costa J; Plant J. 1997 Dec. 12(6),1411-1417, N-glycans harboring the Lewis a epitope are expressed at the surface of plant cells., Fitchette-Laine AC, Gomord V, Cabanes M, Michalski JC, Saint Macary M, Foucher B, Cavelier B, Hawes C, Lerouge P, Faye L). Este enlace es diferente de los encontrados en los animales.

Las glicoproteínas derivadas de humanos incluyen eritropoyetina humana (EPO). Con objeto de producir glicoproteínas con estructuras de cadenas de azúcar similares a las humanas, estas glicoproteínas se producen en células hospedadoras animales. Sin embargo, la EPO producida en las células animales tiene una estructura de cadenas de azúcar que es diferente de la estructura de cadena de azúcar humana natural. Como resultado, la actividad in vivo de EPO es reducida (Takeuchi, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 7819-7822, 1989). Esta estructura de las cadenas de azúcar en otras proteínas derivadas de humanos, tales como hormonas e interferón, se ha analizado y fabricado también con las mismas limitaciones de glicosilación.

Los métodos utilizados para introducir genes exógenos en las plantas incluyen el método de Agrobacterium (Weising, K. et al., Annu. Rev. Genet., 22, 421, 1988), el método de electroporación (Toriyama, K. et al., Bio/Technology, 6, 1072, 1988),...

1. Un método de expresar una glicosiltransferasa y una glicoproteína exógena que tienen una cadena de azúcar de tipo humano en una célula de planta transformada, que comprende un paso en el que se obtiene una célula de planta transformada por introducción en una célula de planta del gen de una glicosiltransferasa y el gen de una glicoproteína exógena, y un paso en el cual se cultiva la célula de planta transformada obtenida.

2. Un método de fabricación de una glicoproteína que tiene una cadena de azúcar de tipo humano, que comprende un paso de expresión de una glicosiltransferasa y una glicoproteína exógena de acuerdo con el método de la reivindicación 1, y un paso en el que la glicoproteína exógena se aísla de la célula de planta transformada.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la glicosiltransferasa es una enzima capaz de conducir una reacción de transferencia de un residuo galactosa a un residuo acetilglucosamina terminal no reductor.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la glicoproteína con una cadena de azúcar de tipo humano comprende una cadena de azúcar interior y una cadena de azúcar exterior, en donde la cadena de azúcar interior comprende una pluralidad de manosa y acetilglucosamina, y en donde la cadena de azúcar exterior contiene una porción de cadena de azúcar terminal con una galactosa terminal no reductora.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la cadena de azúcar exterior tiene una configuración de cadena lineal.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la cadena de azúcar exterior tiene una configuración ramificada.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la porción de la cadena de azúcar ramificada tiene una configuración mono-, bi-, tri- o tetra.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 a la reivindicación 7, en el que la glicoproteína no contiene fucosa ni xilosa.

9. Una célula de planta que tiene un mecanismo de adición de cadenas de azúcar que comprende:

el gen de una primera enzima, en donde la primera enzima es una glicosiltransferasa capaz de conducir una reacción de transferencia de un residuo galactosa a un residuo acetilglucosamina terminal no reductor; y

el gen de una segunda enzima que puede intensificar la primera enzima, en donde la segunda enzima es Manosidasa I (Man I), Manosidasa II (Man II), β-1,4-galactosiltransferasa (GalT) y N-acetilglucosaminiltransferasa I (GlcNAc I), en donde el mecanismo de adición de cadenas de azúcar añade una cadena de azúcar que contiene una cadena de azúcar interior y una cadena de azúcar exterior, en donde la cadena de azúcar interior comprende una pluralidad de manosa y acetilglucosamina, y en donde la cadena de azúcar exterior contiene una porción de cadena de azúcar terminal con una galactosa terminal no reductora.

10. Una planta recombinante, o porción de la misma, que comprende:

el gen de una primera enzima el gen de una primera enzima, en donde la primera enzima es una glicosiltransferasa capaz de conducir una reacción de transferencia de un residuo galactosa a un residuo acetilglucosamina terminal no reductor; y

el gen de una segunda enzima que puede intensificar la primera enzima, en donde la segunda enzima es Manosidasa I (Man I), Manosidasa II (Man II), β-1,4-galactosiltransferasa (GalT) y N-acetilglucosaminiltransferasa I (GlcNAc I), y

en donde la planta recombinante, o porción de la misma, produce glicoproteínas de tipo mamífero, que no comprenden fucosa ni xilosa.

11. Una planta transgénica que comprende:

el gen de una primera enzima el gen de una primera enzima, en donde la primera enzima es una glicosiltransferasa capaz de conducir una reacción de transferencia de un residuo galactosa a un residuo acetilglucosamina terminal no reductor; y

el gen de una segunda enzima que puede intensificar la primera enzima, en donde la segunda enzima es Manosidasa I (Man I), Manosidasa II (Man II), β-1,4-galactosiltransferasa (GalT) y N-acetilglucosaminiltransferasa I (GlcNAc I), en donde la planta transgénica produce glicoproteínas de tipo mamífero que no comprenden fucosa ni xilosa, y

en donde la planta transgénica se regenera a partir de una célula de planta que tiene un mecanismo de adición de cadenas de azúcar que comprende:

el gen de una primera enzima, en donde la primera enzima es una glicosiltransferasa capaz de conducir una reacción de transferencia de un residuo galactosa a un residuo acetilglucosamina terminal no reductor; y

el gen de una segunda enzima que puede intensificar la primera enzima, en donde la segunda enzima es Manosidasa I (Man I), Manosidasa II (Man II), β-1,4-galactosiltransferasa (GalT) y N-acetilglucosaminiltransferasa I (GlcNAc I), en donde el mecanismo de adición de cadenas de azúcar añade una cadena de azúcar que contiene una cadena de azúcar interior y una cadena de azúcar exterior, en donde la cadena de azúcar interior comprende una pluralidad de manosa y acetilglucosamina, y en donde la cadena de azúcar exterior contiene una porción de cadena de azúcar terminal con una galactosa terminal no reductora.