Un método para la producción transitoria de una o más proteínas extracelulares no procedentes de plantas en un protoplasto de musgo,

método que comprende los pasos de transformar transitoriamente el protoplasto con un constructo de ácido nucleico que comprende una o más secuencias nucleotídicas heterólogas codificantes de dicha o dichas proteínas no procedentes de plantas enlazadas operativamente a un promotor, y cultivar el protoplasto transformado a fin de producir dicha o dichas proteínas no procedentes de plantas, en donde dicho cultivo tiene lugar durante al menos 48 horas en un medio de cultivo seleccionado del grupo constituido por W5, 3M y MMS

Método de producción de proteínas.

Campo técnico

La presente invención se refiere en general a métodos y materiales para uso en la expresión de genes, y en particular para la producción de proteína extracelular no procedente de plantas, a partir de protoplastos de musgo.

Técnica anterior

Los sistemas de producción de proteínas recombinantes actualmente en uso abarcan desde sistemas procariotas tales como Escherichia coli y Bacillus, a sistemas eucariotas tales como levadura, células de mamífero, cultivos de células de insecto, animales transgénicos y plantas. Proteínas que tienen modificaciones posteriores a la traducción, v.g. glicosilación y procesamiento de puentes disulfuro, se producen típicamente en sistemas eucariotas. Para producción en gran escala de proteínas recombinantes se han utilizado típicamente líneas de células u organismos transformados de manera estable (es decir, sistemas en los cuales el ácido nucleico de interés se ha integrado en el genoma nuclear), así como sistemas de baculovirus/células de insecto. Por ejemplo, Schaefer et al. (1991) describen un método para la transformación estable de Physcomitrella patens, que comprende cultivar los protoplastos transformados en medio 3M durante 4 a 7 días antes de regenerar la planta. El establecimiento de dichas líneas de células u organismos transformados establemente es un proceso que consume mucho tiempo e intensivo en mano de obra.

La transfección de células de mamífero o células de insecto requiere muchas horas-hombre y el uso de equipo técnico especializado, v.g. cámaras de incubación con CO₂. Ambos factores hacen muy elevado el coste de producción.

Los sistemas de transformación transitoria basados en plantas que se utilizan para la expresión y producción transitoria de proteínas recombinantes están basados en la inoculación de tejidos de plantas o plantas enteras con agrobacterias o con partículas de virus (Vaquero et al. 1999; Fischer et al. 1999; Fischer y Emans 2000; Dirnberger et al. 2001). La transferencia directa de DNA en tejidos de plantas por bombardeo con partículas se ha utilizado también como método para testar la expresión génica antes de la transformación estable (Fischer et al. 1999).

Los sistemas alternativos de transformación transitoria, es decir, sistemas en los cuales el ácido nucleico de interés no está integrado en el genoma nuclear, ofrecen un camino hacia adelante para la expresión eficiente de proteínas heterólogas en cantidades comerciales.

Hasta ahora, la expresión transitoria de proteínas en protoplastos ha sido utilizada únicamente con sistemas informadores para v.g. análisis de promotores (Zeidler et al. 1999); análisis de transducción de señales; direccionamiento y circulación de proteínas; e interacción proteína-proteína (Sheen 2001). Se han utilizado ensayos de informadores en experimentos de transformación transitoria con protoplastos para el análisis de péptidos señal para la secreción de proteínas (v.g. De Loose et al. 1991, Denecke et al. 1990).

La secreción de proteínas recombinantes en el espacio extracelular (apoplasto) utilizando plantas transformadas de manera estable (esporofito) está perfectamente caracterizada (Magnuson et al. 1996, De Wilde et al. 1998) y a primera vista parecía ser una herramienta útil para producción de proteínas en plantas. La secreción de proteínas recombinantes expresadas en cepas transgénicas de musgo transformadas de manera estable (gametofito) directamente en el medio ha sido descrita también (WO 01/25456 A2).

Houba-Herin et al. (1999) describen la introducción de una citoquinina-oxidasa (CKO) de planta (maíz) en protoplastos de musgo en un sistema de ensayo transitorio y el análisis del papel de CKO en el desarrollo de la planta. La doctrina del documento describe la expresión de una citoquinina-oxidasa de planta (maíz) correctamente plegada y glicosilada, y no propone el protoplasto de musgo como posible sistema de producción de proteínas.

Sin embargo, la expresión y secreción transitorias de proteínas recombinantes no procedentes de plantas para producción de proteínas (suficiente para análisis de proteínas, v.g. modificaciones posteriores a la traducción, análisis MALDI-TOF) utilizando protoplastos de musgo transformados directamente por transferencia directa de DNA mediada por PEG no parece haber sido descrita en la técnica anterior.

Sorprendentemente, los autores de la presente invención han encontrado que los protoplastos de musgo transformados transitoriamente (gametofitos) son capaces de expresar niveles altos de proteínas recombinantes no procedentes de plantas que se secretan al medio. Los protoplastos de musgo transformados transitoriamente pueden cultivarse en medios simples, que pueden comprender o no componentes que son adecuados para la estabilización de las proteínas. Adicionalmente, los protoplastos de musgo pueden concentrarse a una alta densidad de células, lo que permite que los mismos se transformen transitoriamente con relativa facilidad y en números elevados para uso en sistemas en los cuales pueden emplearse volúmenes pequeños de medio de cultivo, permitiendo la producción de soluciones concentradas de proteínas que facilitan los análisis ulteriores que requieren volúmenes pequeños pero concentraciones altas de proteína (v.g. modificaciones posteriores a la traducción).

Descripción de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para la producción transitoria de (una) o más proteínas extracelulares no procedentes de plantas en un protoplasto de musgo, método que comprende los pasos de transformar transitoriamente el protoplasto con un constructo de ácido nucleico que comprende (a) una o más secuencias heterólogas de nucleótidos que codifican dicha o dichas proteínas no procedentes de plantas enlaza- da(s) operativamente a un promotor, y cultivar el protoplasto transformado a fin de producir dicha o dichas proteínas no procedentes de plantas, en donde dicho cultivo tiene lugar durante al menos 48 horas en un medio de cultivo seleccionado del grupo constituido por W5, 3M y MMS.

Aspectos particulares de la invención se describirán a continuación con mayor detalle.

Definiciones

El término "heterólogo" se utiliza ampliamente más adelante para indicar que el gen/secuencia de nucleótidos en cuestión se ha (n) introducido transitoriamente en protoplastos de musgo utilizando ingeniería genética, v.g. por intervención humana. Una secuencia heteróloga de nucleótidos puede comprender la secuencia codificante de una proteína de fusión constituida por una pareja de fusión que puede estar formada, por ejemplo, en parte por una proteína de planta que puede estar fusionada a una proteína no procedente de plantas, lo que puede denominarse una proteína de fusión híbrida planta : no planta para los propósitos de la presente invención. Una proteína de fusión híbrida de este tipo puede considerarse también como una proteína no procedente de plantas para los propósitos de la presente invención. Alternativamente, una proteína de fusión puede ser una que está formada por parejas de fusión que no son de origen vegetal. Un gen heterólogo puede aumentar la expresión de una proteína de interés a partir de un gen endógeno equivalente, es decir uno que realiza normalmente la misma función o una función similar, o la secuencia insertada puede ser adicional al gen endógeno u otra secuencia. El ácido nucleico heterólogo a una célula puede ser no existente naturalmente en protoplastos de musgo de dicho tipo, variedad o especie. Así, el ácido nucleico heterólogo puede comprender una secuencia codificante de, o derivada de, un tipo particular de organismo, tal como una especie de mamífero, v.g. de especie humana, ovina, bovina, equina, o porcina, puesto en el contexto de un protoplasto del musgo, tal como un protoplasto derivado de Physcomitrella patens. Una proximidad adicional corresponde a una secuencia de ácido nucleico a situar dentro de un protoplasto de musgo en el cual se encuentra naturalmente la misma o un homólogo de la misma, pero en el cual la secuencia de ácido nucleico está enlazada y/o adyacente a un ácido nucleico que no existe naturalmente en la célula, o células de dicho tipo o especie o variedad de planta, por ejemplo enlazado operativamente a una o más secuencias reguladoras, tales como una secuencia promotora, para control de la expresión.

El término "gen",...

1. Un método para la producción transitoria de una o más proteínas extracelulares no procedentes de plantas en un protoplasto de musgo, método que comprende los pasos de transformar transitoriamente el protoplasto con un constructo de ácido nucleico que comprende una o más secuencias nucleotídicas heterólogas codificantes de dicha o dichas proteínas no procedentes de plantas enlazadas operativamente a un promotor, y cultivar el protoplasto transformado a fin de producir dicha o dichas proteínas no procedentes de plantas, en donde dicho cultivo tiene lugar durante al menos 48 horas en un medio de cultivo seleccionado del grupo constituido por W5, 3M y MMS.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente el paso de obtener dicha o dichas proteínas no procedentes de plantas del medio de cultivo.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el protoplasto es de Physcomitrella patens.

4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el volumen del medio de cultivo está comprendido en el intervalo de 50 µl - 1000 µl.

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el volumen del medio de cultivo está comprendido en el intervalo de 100 µl - 600 µl.

6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el volumen del medio de cultivo está comprendido en el intervalo de 100 µl - 300 µl.

7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el volumen del medio de cultivo es 200 µl pm 50 µl.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ácido nucleico heterólogo comprende dos o más secuencias nucleotídicas heterólogas.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde los ácidos nucleicos están presentes en un solo constructo vector.

10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el promotor es un promotor inducible.

11. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia nucleotídica heteróloga codifica una proteína o polipéptido que es una proteína animal.

12. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia nucleotídica heteróloga codifica una proteína o polipéptido que es una proteína de mamífero.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, en donde la secuencia nucleotídica heteróloga codifica una proteína seleccionada del grupo constituido por un heterodímero, un anticuerpo de fusión, una inmunoglobulina, y un anticuerpo monocatenario.

14. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la secuencia nucleotídica heteróloga codifica una proteína o polipéptido que es una proteína fúngica.

15. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la secuencia nucleotídica heteróloga codifica una proteína o polipéptido que es una proteína bacteriana.