SÍNTESIS DEL ÁCIDO SIÁLICO EN PLANTAS.

La presente invención se relaciona con la síntesis del ácido siálico en plantas. Adicionalmente la presente invención proporciona los métodos y las plantas que producen el ácido siálico, y las proteínas sialiladas producidas a partir de estas plantas. Antecedentes de la invención Las plantas son potencialmente una fábrica de bajo coste y de contaminación segura, para la producción de proteínas farmacéuticas recombinantes. La mayoría de las proteínas recombinantes producidas en las plantas no se distinguen de sus homólogos mamíferos, en cuanto la secuencia de aminoácido, conformación y actividad biológica. Adicionalmente, las glicoproteínas de mamífero son glicosilados eficientemente cuando se expresan en plantas transgénicas. Sin embargo, las plantas producen moléculas con N-glicanos que difieren de aquellos encontrados en glicoproteínas de origen animal (Lerouge et al., 1998). Esto puede limitar el uso de productos farmacéuticos hechos de plantas, ya que la presencia de glicoepítopes específicos de vegetales en estas proteínas puede producir respuestas inmunes en humanos (Bardor et al., 2003), así como la ausencia de epítopes del tipo de mamífero, tales como secuencias sialiladas, puede inducir su rápido evacuación del flujo sanguíneo. Como una consecuencia, que controla la N-glicosilación de los productos farmacéuticos hechos de plantas, es un requisito para su uso en terapia humana. En el remoldeo de las plantas han surgido recientemente estrategias para obtener anticuerpos derivados de vegetales con perfiles de carbohidratos compatibles a humanos. Algunas estrategias involucran la retención de los planticuerpos en el retículo endoplasmático (Ko et al., 2003; Sriraman et al., 2004, Triguero et al., 2005), otras involucran la transformación de plantas con glicosiltransferasas de mamífero. Por ejemplo, la N-glicosilación de las plantas se puede humanizar parcialmente mediante la transformación de la planta con una ß(1,4)galactosiltransferasa humana (Palacpac et al., 1999; Bakker et al., 2001). La expresión de un anticuerpo de murine en una planta transformada resulta en la producción de un anticuerpo derivado de la planta que albergan un perfil de galactosilación similar al observado en la correspondiente IgG de murina (Bakker et al., 2001). Los IgGs de mamífero llevan N-glicanos bi-antenarios en el sitio conservado de la N-glicosilación localizado en el dominio Fc. Estos oligosacáridos son débilmente sialilados, y la ausencia del Neu5Ac terminal no interfiere con la función y estabilidad del anticuerpo. En contraste, la mayoría de las otras glicoproteínas en circulación tienen N- glicanos antenarios di-, tri o tetra sialilados. La presencia de ácidos siálicos terminales sobre estos glicanos se requiere para numerosas funciones biológicas, siendo la primera el control de la vida media de la proteína en el sistema circulatorio. En la ausencia de ácidos siálicos terminales, las glicoproteínas se detectan por los receptores asialoglicoproteína hepática y se eliminan del suero, representando estas proteínas de vida biológicamente corta e ineficaz (Kelm and Schauer, 1997). Por lo tanto, los productos farmacéuticos hechos de plantas no-sialilados se pueden eliminar rápidamente de la corriente sanguínea cuando se inyectan a un ser humano, por ejemplo, una Epo derivada del tabaco fue biológicamente activa in vitro pero no funcional in vivo, debido a su eliminación de la circulación antes de que alcance los tejidos eritropoyéticos (Matsumoto et al., 1995). La remodelación de los N-glicanos ligados a los planticuerpos en N-glicanos similares a humanos, ya se ha logrado parcialmente en plantas, mediante la expresión de una ß(1,4)-galactosiltransferasa humana (Palacpac et al., 1999; Bakker et al., 2001), una transferasa que utiliza la UDP-Gal endógena como co-sustrato. Una sialiltransferasa de mamífero también ha sido introducida en las plantas y se demostró que es funcional y se dirige correctamente al aparato de Golgi (Wee et al., 1998). Sin embargo, no se observó sialilación de oligosacáridos endógenos. La presencia de ácidos siálicos así como la maquinaria de sialilación en plantas es todavía un tema de debate. Sin embargo, Neu5Ac, el principal ácido siálico presente en humanos, así como su precursor N-acetilmanosamina (D- ManNAc) no parece que se sintetice en las plantas en cantidades detectables (Séveno et al., 2004). Como consecuencia, la glico-ingeniería de N-glicanos en la planta en oligosacáridos sialilados necesita la co-expresión de enzimas exógenas capaces de catalizar la síntesis, la activación y la transferencia en el aparato de Golgi de Neu5Ac. En los mamíferos y las bacterias, el anabolismo y catabolismo de Neu5Ac ocurre a través de diferentes rutas (Angata and Varki, 2002). Dos clases principales de enzimas se necesitan para formar Neu5Ac. N-acetilneuraminato liasa (liasa de Neu5Ac) se involucra en el catabolismo de los ácidos siálicos mediante la catálisis de la división de Neu5Ac en N-acetilmanosamina (D-ManNAc) y piruvato en una reacción reversible. A altas concentraciones de D- ManNAc y piruvato, el equilibrio se puede cambiar a la síntesis de Neu5Ac. Acoplado a una actividad de la 2epimerasa glucosamina, liasa de Neu5Ac a partir de la E. coli fue utilizada para la producción a gran escala de Neu5Ac a partir de D-GlcNAc (Maru et al., 1998). De manera alternativa, la sintasas del Neu5Ac, tales como NeuB, 2   catalizan la condensación de ManNAc en fosfoenol piruvato (PEP) y se involucran directamente en la biosíntesis de los ácidos siálicos (revisado en Tanner, 2005). Resumen de la invención La presente invención se relaciona con la síntesis del ácido siálico en plantas. Adicionalmente, la presente invención proporciona los métodos y las plantas que producen ácido siálico, y las proteínas sialiladas producidas a partir de estas plantas. Es un objeto de la invención proporcionar un método mejorado para producir el ácido siálico en una planta. De acuerdo con la presente invención se proporciona un método para sintetizar el ácido siálico que comprende, i) cultivo de una planta transgénica, que comprende una secuencia de nucleótidos codificadora de la sintasa del ácido 1 2 N-acetil neuramínico (Neu5Ac) microbiana, la secuencia de nucleótidos ligada operativamente con una región reguladora que es activa en la planta, y ii) expresión de la secuencia de nucleótidos, sintetizando así el ácido siálico. Adicionalmente, después de la etapa de expresión, el ácido siálico se puede recuperar a partir de la planta. La región reguladora se puede seleccionar del grupo que consiste de un promotor constitutivo, un promotor inducible, un promotor específico de tejido, y un promotor de desarrollo. La presente invención también se refiere al método definido anteriormente, en donde en la etapa de proporcionar, la planta además comprende una segunda secuencia de nucleótidos codificadora una o más de una epimerasa, una sintasa del CMP-Neu5Ac, un transportador del CMP-Neu5Ac, una galactosiltransferasa, y una sialiltransferasa, ligada operativamente a una o más de una segunda región reguladora activa dentro de la planta, y la segunda secuencia de nucleótidos es co-expresada junto con la expresión de la secuencia de nucleótidos. Adicionalmente, la segunda región reguladora se puede seleccionar a partir del grupo que consiste de un promotor constitutivo, un promotor inducible, un promotor específico de tejido, y un promotor de desarrollo. La presente invención también se refiere al método como se describe anteriormente (Método A), en donde la secuencia de nucleótidos codificadora sintasa del Neu5Ac la segunda secuencia de nucleótidos codificadora una o más de una de la epimerasa, sintasa de CMP-Neu5Ac, o transportador del CMP-Neu5Ac, o ambas la secuencia de nucleótidos, y la segunda secuencia de nucleótidos es optimizada por el codón para la expresión dentro de la planta. La presente invención proporciona una planta, una célula vegetal, o una semilla, que comprende una secuencia de nucleótidos codificadora de la sintasa del Neu5Ac ligada operativamente con una región reguladora que es activa en la planta. La planta, la célula vegetal o la semilla además puede comprender una segunda secuencia de nucleótidos codificadora de una o más de una epimerasa, una sintasa de CMP-Neu5Ac, un transportador del CMP-Neu5Ac, una galactosiltransferasa, y una sialiltransferasa, ligada operativamente a una o más de una segunda región reguladora activa dentro de la planta. Adicionalmente, la región reguladora y la segunda región reguladora se pueden seleccionar a partir del grupo que consiste de un promotor constitutivo, un promotor inducible, un promotor específico de tejido, y un promotor de desarrollo. Como se describe en este documento, la expresión en plantas de enzimas que... [Seguir leyendo]

1. Un método para sintetizar el ácido siálico que comprende, i) cultivo de una planta transgénica que comprende una secuencia de nucleótidos codificadora de la sintasa del ácido N-acetil neuramínico (Neu5Ac) microbiana, la secuencia de nucleótidos ligada operativamente con una región reguladora que es activa en la planta, y ii) expresión de la secuencia de nucleótidos, sintetizando así el ácido siálico. 2. El método de la reivindicación 1, en donde el ácido siálico es el Neu5Ac, y en donde después de la etapa de expresión, el Neu5Ac se recupera a partir de la planta transgénica. 3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la planta transgénica además comprende una segunda secuencia de nucleótidos codificadora de una o más de una epimerasa, una sintasa de CMP-Neu5Ac, o una transportador de CMP-Neu5Ac, ligada operativamente a una o más de una segunda región reguladora activa dentro de la planta transgénica, y la segunda secuencia de nucleótidos es co-expresada junto con la expresión de la secuencia de nucleótidos. 4. Una planta, una célula vegetal, o una semilla, que comprende una secuencia de nucleótidos codificadora de una sintasa de Neu5Ac microbiana ligada operativamente con una región reguladora que es activa en la planta. 5. La planta, la célula vegetal o la semilla de la reivindicación 4, que además comprende una segunda secuencia de nucleótidos codificadora de una o más de una epimerasa, una sintasa de CMP-Neu5Ac, un transportador de CMP- Neu5Ac, una galactosiltransferasa, y una sialiltransferasa, ligada operativamente a una o más de una segunda región reguladora activa dentro de la planta, célula vegetal, o la semilla. 6. La planta, célula vegetal, o semilla de la reivindicación 5, que además comprende una tercera secuencia de nucleótidos codificadora de una proteína de interés ligada operativamente con una o más de una región reguladora que es activa en la planta, célula vegetal, o la semilla. 7. La planta, la célula vegetal o la semilla de la reivindicación 6, en donde la secuencia de nucleótidos codificadora de la sintasa de Neu5Ac bacteriana, la segunda secuencia de nucleótidos codificadora una o más de una epimerasa, sintasa de CMP-Neu5Ac, transportador de CMP-Neu5Ac, galactosiltransferasa, sialiltransferasa, y/o la tercera secuencia de nucleótidos codificadora de la proteína de interés, es optimizada por el codón para la expresión dentro de la planta, célula vegetal, o la semilla. 8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la planta transgénica se transforma de forma transitoria. 17   18   19     REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCION Esta lista de referencias citada por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citadas en la descripción US 5428147 A [0043] US 4945050 A [0053] US 5036006 A [0053] US 5100792 A [0053] Literatura no-patente citada en la descripción Sardana et al. Plant Cell Reports, 1996, vol. 15, 677-681 [0029] Murray et al. Nuc Acids Res., 1989, vol. 17, 477-498 [0029] Maniatis et al. Molecular Cloning (A Laboratory Manual). Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, 387-389 [0038] Current Protocols in Molecular Biology. Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc, 1989, vol. 1, 2.10.3 [0038] Rask et al. J. Plant Physiol., 1998, vol. 152, 595-599 [0041] Bilodeau et al. Plant Cell, 1994, vol. 14, 125-130 [0041] Gatz, C.; Lenk, I.R.P. Trends Plant Sci., 1998, vol. 3, 352-358 [0042] Gatz, C. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1997, vol. 48, 89-108 [0042] Aoyama, T. ; Chua, N.H. Plant J., 1997, vol. 2, 397-404 [0042] Salter, M.G. et al. Plant Journal, 1998, vol. 16, 127-132 [0042] Caddick, M.X. et al. Nature Biotech., 1998, vol. 16, 177-180 [0042] Brandstatter, I. ; Kieber, J.J. Plant Cell, 1998, vol. 10, 1009-1019 [0042] Kakimoto, T. Science, 1996, vol. 274, 982-985 [0042] Ulmasov, T. et al. Plant Cell, 1997, vol. 9, 1963-1971 [0042] Odell et al. Nature, 1985, vol. 313, 810-812 [0043] Zhang et al. Plant Cell, 1991, vol. 3, 1155-1165 [0043] An et al. Plant J., 1996, vol. 10, 107-121 [0043] Xu. Plant Physiol., 1994, vol. 106, 459-467 [0043] Cornejo et al. Plant Mol. Biol., 1993, vol. 29, 637-646 [0043] Holtorf et al. Plant Mol. Biol., 1995, vol. 29, 637-646 [0043] Mandel et al. Plant Mol. Biol., 1995, vol. 29, 995-1004 [0043] 21   Weissbach ; Weissbach. Methods for Plant Molecular Biology. Academy Press, 1988, 421-463 [0053] Geierson ; Corey. Plant Molecular Biology. 1988 [0053] Fundamentals of Gene Transfer in Plants. Miki ; Iyer. Plant Metabolism. Addison Wesly, Langmans Ltd, 1997, 561- 579 [0053] Bilang et al. Gene, 1991, vol. 100, 247-250 [0053] Scheid et al. Mol. Gen. Genet., 1991, vol. 228, 104-112 [0053] Guerche et al. Plant Science, 1987, vol. 52, 111-116 [0053] Neuhause et al. Theor. Appl Genet., 1987, vol. 75, 30-36 [0053] Klein et al. Nature, 1987, vol. 327, 70-73 [0053] Howell et al. Science, 1980, vol. 208, 1265 [0053] Horsch et al. Science, 1985, vol. 227, 1229-1231 [0053] DeBlock et al. Plant Physiology, 1989, vol. 91, 694-701 [0053] Methods for Plant Molecular Biology. Academic Press Inc, 1988 [0053] Methods in Plant Molecular Biology. Academic Press Inc, 1989 [0053] Liu; Lomonossoff. J Virol Meth, 2002, vol. 105, 343-348 [0053] Liu; Lomonossoff. Journal of Virological Methods, 2002, vol. 105, 343-348 [0054] [0080] Angatta, T. ; Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related -keto acids: an evolutionary perspertive. Chem Rev., 2002, vol. 102, 439-469 [0095] Bakker, H. ; Bardor, M. ; Molhoff, J. ; Gomord, V. ; Elbers, I. ; Stevens, L. ; Jordi, W. ; Lommen, A. ; Faye, L. ; Lerouge, P. Humanized glycans on antibodies produced by transgenic plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, vol. 98, 2899-2904 [0095] Bardor M; Faveeuw C ; Fitchette A-C ; Gilbert D ; Galas L ; Trottein F ; Faye L ; Lerouge P. Immureactivity in mammals of two typical plant glyco-epítopes, core-alpha(1,3)-fucose and core-xylose. Glycobiology, 2003, vol. 13, 427-434 [0095] Bravo, I. G. ; Garcia-Vallvé, S. ; Romeu, A. ; Reglero, A. Prokaryotic origin of cytidyltransferases and K-ketoacid synthases. Trends in Microbiol., 2004, vol. 12, 120-128 [0095] Production of antibodies in alfalfa (Medicage sativa). Busse, U. ; Levée, V. ; Trépanier, S. ; Vézina, L. Molecular Farming ofplants and animal for human and veterinary medicine. J. Wiley and sons, 2001, 199-219 [0095] Delmas F ; Petit J ; Joubes J ; Séveno M ; Paccalet T ; Hemould M ; Lerouge P ; Mouras A ; Chevalier C. The gene expression and enzyme activity of plant 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid-8-phosphate synthase are preferentially associated with cell division in a cell cycle-dependent manner. Plant Physiol., 2003, vol. 133, 348-360 [0095] Production of foreign proteins in tobacco cell suspension culture. Gomord, V. ; Fitchette-Lainé, A.-C. ; Denmat, L.-A. ; Michaud, D. ; Faye, L. Methods in Biotechnology. Humana Press, 1998, 155-164 [0095] Hofgen, R ; Willmitzer L. Storage of competent cells for Agrobacterium transformation. Nucleic Acids Res, 1988, vol. 16, 9877 [0095] Kelm, S. ; Schauer, R. Sialic acids in molecular and cellular interactions. Int. Rev. Cytol., 1997, vol. 175, 137-240 [0095] 22   Ko, K. ; Tekoah, Y. ; Rudd, P.M. ; Harvey, D.J. ; Dwek, R.A. ; Spitsin, S. ; Hanlon, C.A. ; Rupprecht C. ; Dietzschold, B. ; Golovkin, M. Function and glycosylation of plant-derived antiviral monoclonal antibody. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 2003, vol. 101, 8013-8018 [0095] Lerouge, P. ; Cabanes-Macheteau, M. ; Rayon, C. ; Fitchette-Lainé, A.-C. ; Gomord, V. ; Faye, L. N-glycoprotein biosynthesis: recent development and future trends. Plant Mol. Biol., 1998, vol. 38, 31-48 [0095] Maru, I. ; Ohnishi, J. ; Ohta, Y. ; Tsukada, Y. Simple and large-scale production of N-acetylneuraminic acid from Nacetyl-D-glucosamine and pyruvate using N-acyl-D-glucosamine epimerase and N-acetylneuraminate layse. Carbohydr. Res., 1998, vol. 306, 575-578 [0095] Matsumoto, S. ; Ikura, K. ; Ueda, M. ; Sasaki, R. Characterization of a human glycoprotein (erythropoietin) produced in cultured tobacco cells. Plant Mol. Biol., 1995, vol. 27, 1163-1172 [0095] Misaki, R. ; Fujiyama, K. ; Seki, T. Expression of human CMP-N-acetyneuraminic acid synthetase and CMP-sialic acid transporter in tobacco suspension-cultured cell. Biochem. Biophys. Res. Comm., 2006, vol. 339, 1184-1189 [0095] Murashige, T. ; Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 1962, vol. 15, 473 [0095] Pagny, S. ; M. Cabanes-Macheteau ; J. W. Gillikin ; N. Leborgne-Castel ; P. Lerouge ; R. S. Boston ; L. Faye ; V. Gomord. Protein recycling from the Golgi apparatus to the endoplasmic reticulum in plants and its minor contribution to calreticulin retention. Plant Cell, 2000, vol. 12, 739-756 [0095] Palacpac, N.Q. ; Yoshida, S. ; Sakai, H. ; Kimura, Y. ; Fujiyama, K. ; Yoshida, T. ; Seki, T. Stable expression of human beta 1,4-galactosyltransferase in plant cells modifies N-linked glycosylation patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, vol. 9.6, 4692-4697 [0095] Ray, P.H. Purification and characterization of 3-deoxy-D-manno-octulosonic 8-phosphate synthase from Escherichia coli. J. Bacteriol., 1980, vol. 141, 635-644 [0095] Sriraman, R. ; Bardor, M. ; Sack, M. ; Vaquero, C. ; Faye, L. ; Fischer, R. ; Finnern R. ; Lerouge, P. Recombinant anti-hCG antibodies retained in the endoplasmic reticulum of transformed plants lack core xylose and core K(1,3)fucose residues. Plant Biotech. J., 2004, vol. 2, 279-287 [0095] Séveno, M. ; Bardor, M. ; Paccalet, T. ; Gomord, V. ; Lerouge, P. ; Faye, L. Glycoprotein sialylation in plants?. Nature Biotech., 2004, vol. 22, 5-6 [0095] Strohmaier, H. ; Remler, P. ; Renner, W. ; Högenauer, G. Expression of genes kdsA and kdsB involved in 3-deoxy- D-manno-octulosonic acid metabolism and biosynthesis of enterobacterial lipopolysaccharide is growth phase regulated primary at the transcriptional level in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol., 1995, vol. 177, 4488-4500 [0095] Tian, L. ; Wang, H. ; Wu, K ; Latoszek-Green, M. ; Hu, M. ; Miki, B. ; Brown, D.C.W. Efficient recovery of transgenic plants through organogenesis and embryogenesis using cryptic promoter to drive marker gene expression. Plant Cell Rep., 2002, vol. 20, 1181-1187 [0095] Triguero, A. ; Cabrera, G. ; Cremata, J. ; Yuen, C-T. ; Wheeler J. ; Ramirez N.I. Plant-derived mouse IgG monoclonal antibody fused to KDEL endoplasmic reticulum-retention signal is N-glycosylated homogeneously throughout the plant with mostly high-mannose-type N-glycans. Plant Biotech. J., 2005, vol. 3, 449-457 [0095] Tanner, M. E. The enzymes of sialic acid biosynthesis. Bioorg. Chem., 2005, vol. 33, 216-228 [0095] Wee, E.Q. ; Sherrier, D.J. ; Prime, T.A. ; Dupree, P. Targeting of active sialyltransfcrase to the plant Golgi apparatus. Plant Cell, 1998, vol. 10, 1759-1768 [0095] 23