MÉTODO DE EXPRESIÓN DE PÉPTIDOS PEQUEÑOS USANDO PROTEÍNAS DE CEREAL QUE NO SON PROTEÍNAS DE ALMACENAMIENTO COMO PORTADOR DE FUSIÓN EN EL ENDOSPERMO Y USO DE LOS MISMOS.

Método de expresión de péptidos pequeños usando proteínas de cereal que no son proteínas de almacenamiento como portador de fusión en el endospermo y uso de los mismos Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la ingeniería genética. Particularmente, la presente invención se refiere a un método de expresión de péptidos pequeños en el endospermo usando proteínas de cereal que no son proteínas de almacenamiento como portadores de fusión y el uso de los mismos, es decir, un método en el que se usaron células de endospermo de cereales tales como arroz y cebada como biorreactores y se aplicó la estrategia de proteína de fusión para introducir el casete de expresión específico del endospermo usando cualquier proteína que no es una proteína de almacenamiento (por ejemplo, Bip y PDI de cultivos de cereales) como las parejas de fusión en las células de arroz o cebada, lo que conduce a la acumulación masiva de los péptidos pequeños en células de endospermo de un arroz o cebada transgénico. La presente invención también se refiere a péptidos de origen vegetal producidos mediante el método. Antecedentes de la invención Se denomina péptidos pequeños a aquéllos con menos de 100 aminoácidos de longitud. En los últimos años, se usaron ampliamente péptidos pequeños en los campos de la medicina, tratamiento de enfermedades, vacunas moleculares, etc., lo que incluye antígenos de superficie, diagnóstico de enfermedades y tratamiento de SIDA y cáncer. Con el rápido desarrollo de la biotecnología, se descubrieron cada vez más péptidos pequeños. Por consiguiente, se necesitan una gran cantidad de péptidos para satisfacer el requisito en una variedad de industrias tales como investigación funcional, experimentos clínicos y tratamiento de enfermedades. Generalmente, la síntesis química es la vía principal para producir péptidos con menos de 40 aminoácidos de longitud. Durante el proceso de síntesis química, debido a la existencia de ciertas modificaciones químicas y reacciones químicas incompletas, incluso péptidos con menos de 40 aminoácidos son difíciles de sintetizar (Dobeli, et al., 1998, Protein Expression & Purification, Vol, 12: 404-414). Por tanto, resultó ventajoso y necesario utilizar un biosistema para producir péptidos. En la década de 1950, se usaban bacterias como biorreactores para producir productos farmacéuticos. Sin embargo, debido a que las bacterias son procariotas, que no poseen el sistema de procesamiento del eucariota, su aplicación está limitada seriamente para algunas proteínas cuyas bioactividades se basan en la modificación de proteínas. Como biorreactor de segunda generación, se ha usado la levadura en la producción de productos de medicina desde la década de 1970. Sin embargo, los problemas de bajo rendimiento y procesamiento/modificación incompleta limitaron seriamente el uso extensivo de la levadura. El biorreactor de tercera generación utilizó células animales y de plantas superiores. En la actualidad, los biorreactores eucariotas se clasifican en biorreactores animales y biorreactores vegetales, y el biorreactor animal incluye además cultivos celulares y animales transgénicos. Actualmente, los anticuerpos principales para uso farmacéutico se producen mediante el cultivo de líneas celulares de CHO (o de ratón). Los estudios de animales transgénicos principalmente se centran en la expresión de proteína recombinante en células mamarias de vaca transgénica o albúmina de huevo. Sin embargo, los problemas de contaminación por patógenos animales, alto coste y alta necesidad de inversión limitan gravemente su uso. Se estima que la capacidad de producción máxima de anticuerpo monoclonal es de aproximadamente 1.000 kg por año a nivel mundial. Para obtener otros 1.000 kg, se necesitan adicionalmente 40 mil millones de dólares estadounidenses de inversión y más de diez años de tiempo. Todos estos datos indican que el actual sistema productivo y la capacidad de producción de la proteína recombinante están muy lejos de satisfacer la necesidad del mercado. Por consiguiente, se necesita un sistema de expresión altamente eficaz y seguro para satisfacer la gran demanda del mercado de producción de péptidos pequeños. En la mayoría de los casos, se necesitan péptidos con al menos 80 aminoácidos para la expresión de proteína recombinante. Incluso en tal caso, el nivel de expresión es bastante bajo. Por tanto, una manera principal para mejorar el nivel de expresión del péptido es usar una estrategia de proteína de fusión. Hasta ahora, los estudios en sistemas de expresión de proteína de fusión son adecuados principalmente para sistemas de levadura y Escherichia coli (E. coli). Por ejemplo, se usaron proteína de unión a maltosa (MBP), FLAG (Einhauer et al, 2001, J. Biochem.Biophys.Methods, Vol 49:455-465) y glutatión (GST) (Papaioannou et al, 2002, Protein Expression & Purification, Vol.13: 462-466) como parejas de fusión en E. coli y levadura. Aunque algunos sistemas de expresión de proteína de fusión se han comercializado, se usaron meramente en investigaciones básicas en laboratorios. Los estudios sobre la expresión de péptidos en un sistema de expresión vegetal son relativamente nuevos y no han logrado mucho progreso hasta ahora. Recientemente, se ha notificado que se usó el portador de fusión de la dismutasa unida a disulfuro (PDI) y proteína fluorescente verde (GFP) para expresar un péptido. Desafortunadamente, el nivel de expresión fue bastante bajo. Por otro lado, muchos péptidos se han expresado satisfactoriamente en sistemas de Escherichia coli y levadura, existiendo un riesgo obvio de contaminación por patógenos de los huéspedes. Además, los problemas de nivel de expresión bajo y formación de cuerpos de inclusión insolubles en células de E. coli, y el peso molecular superior de las parejas de fusión usadas en procariotas provocan problemas al procesamiento posterior y por tanto no son adecuados para usarse en eucariotas, especialmente en células de plantas superiores. Aunque se han usado células vegetales para expresar péptidos, el 2   nivel de expresión bajo siempre ha sido un problema que ha obstaculizado las investigaciones. Debido a los defectos y las limitaciones mencionados anteriormente, desarrollar vectores de expresión de proteína de fusión en plantas superiores se vuelve cada vez más importante. Usar una planta superior como biorreactor tiene las ventajas del bajo coste, expresión de nivel alto, fácil de escalar, libre de contaminación por patógenos, etc., convirtiéndose en un candidato prometedor para la futura producción de péptidos. Hasta ahora, debido a los problemas de peso molecular relativamente alto, ausencia de señales de transporte a orgánulos celulares, etc., los sistemas de expresión de fusión de procariotas no son adecuados para expresiones en células de plantas superiores. Por tanto, es importante explorar y desarrollar un sistema de expresión de péptidos pequeños que sea adecuado para plantas superiores. Usando la proteína de almacenamiento de arroz como portador de fusión, Ventria Bioscience Inc. en Estados Unidos ha expresado satisfactoriamente péptidos pequeños. No obstante, aunque se logró una expresión de nivel superior por la compañía con el uso de globulina como portador de proteína de fusión, su aplicación era limitada en muchos aspectos puesto que el uso de globulina para expresar péptidos provocó problemas de solubilidad. Aparte de las proteínas de almacenamiento, otras dos proteínas expresadas masivamente en el endospermo del arroz son la proteína de unión a retículo endoplásmico (BiP) y la proteína dismutasa unida a disulfuro (PDI), que están almacenadas ambas en el cuerpo de proteína I. El extremo C-terminal de la proteína Bip tiene actividad chaperona molecular, facilitando el plegado correcto de la proteína en una conformación de proteína funcional. El uso del extremo C-terminal de la proteína Bip como portador de fusión puede no sólo acumular la proteína de fusión dentro de los cuerpos de proteína (similar a la acumulación de la proteína de almacenamiento en cuerpos de proteína), sino también aumentar la solubilidad de la proteína de fusión, superando de ese modo el problema de insolubilidad que resulta del uso de la proteína de almacenamiento como portador de fusión en métodos convencionales. Otra proteína que no es una proteína de almacenamiento que se expresa altamente en el endospermo de arroz o trigo es proteína disulfuro isomerasa (PDI). La PDI tiene dos funciones. Una es la actividad disulfuro dismutasa en el extremo N-terminal, y la otra es que el extremo C-terminal tiene actividad chaperona molecular. Por consiguiente, el uso de su extremo C-terminal como portador de proteína de fusión puede lograr también los propósitos de mejorar... [Seguir leyendo]

1. Método de uso de una proteína de cereal que no es una proteína de almacenamiento como portador de fusión para expresar altamente un péptido pequeño en células de endospermo del huésped, que comprende las etapas de: (i) proporcionar el promotor específico del endospermo y la secuencia de péptido señal de SEQ ID NO:1; (ii) proporcionar el gen de la proteína de cereal que no es una proteína de almacenamiento como portador de fusión y un gen diana que codifica para el péptido pequeño; (iii) construir un vector de expresión que contiene la secuencia líder de ADN y el promotor, el gen del portador de fusión y el gen diana; y (iv) expresar el vector de expresión en una célula de endospermo del huésped, en el que el péptido pequeño tiene menos de 100 aminoácidos, y en el que la proteína de cereal que no es una proteína de almacenamiento se selecciona del grupo que consiste en el extremo C-terminal de la proteína de unión a retículo endoplásmico (Bip) codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3, y el extremo C-terminal de la proteína disulfuro isomerasa (PDI) codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:4. 2. Método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la etapa de optimizar al menos uno del promotor y la secuencia de péptido señal, el gen del portador de fusión y el gen diana en codones de preferencia del huésped, antes de la etapa de construir el vector de expresión. 3. Método de la reivindicación 1 ó 2, que comprende además la etapa de incorporar un marcador seleccionable en el vector. 4. Método de la reivindicación 3, en el que el huésped es arroz, trigo o cebada; y el gen diana es un péptido pequeño terapéutico. 5. Método de la reivindicación 4, en el que el huésped es arroz, y el péptido pequeño terapéutico es IGF-1 humano. 6. Método de la reivindicación 4, en el que el huésped es cebada, y el péptido pequeño terapéutico es IGF-1 humano. 7. Vector de expresión para la expresión de alto nivel y específica de un péptido pequeño heterólogo en células de endospermo de cereal, que comprende un gen quimérico que comprende: (a) una secuencia líder de ADN que codifica para el promotor específico del endospermo y la secuencia del péptido señal de SEQ ID NO:1; (b) un gen seleccionado del grupo que consiste en el extremo C-terminal de la proteína de unión al retículo endoplásmico (Bip) codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3, y el extremo C-terminal de la proteína disulfuro isomerasa (PDI) codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:4 como portador de fusión; y (c) un gen diana que codifica para el péptido pequeño, todos operativamente unidos para permitir la expresión de la proteína de fusión del portador de fusión y el gen diana en una célula de endospermo del huésped, en el que el péptido pequeño tiene menos de 100 aminoácidos. 8. Vector de expresión de la reivindicación 7, en el que al menos uno del promotor y la secuencia de péptido señal, el gen del portador de fusión y el gen diana tiene codones optimizados para su expresión en la célula huésped. 9. Vector de expresión de la reivindicación 8, en el que el gen diana es un péptido pequeño terapéutico. 10. Vector de expresión de la reivindicación 9, en el que el vector comprende además al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: un origen de replicación, un marcador seleccionable, un terminador de traducción y un terminador de transcripción. 11. Vector de expresión de la reivindicación 10, en que el gen diana es IGF-1 humano. 12. Uso de una proteína de cereal que no es una proteína de almacenamiento como portador de fusión para 19   expresar un péptido pequeño en una célula de endospermo vegetal, en el que el péptido pequeño tiene menos de 100 aminoácidos y en el que la proteína de cereal que no es una proteína de almacenamiento se selecciona del grupo que consiste en el extremo C-terminal de la proteína de unión a retículo endoplásmico (Bip) codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3, y el extremo C-terminal de la proteína disulfuro isomerasa (PDI) codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:4. 13. Uso de la reivindicación 12, en el que el péptido pequeño es un péptido terapéutico. 14. Uso de la reivindicación 13, en el que el péptido pequeño es IGF-1.   21   22   23   24     26   27   28