MEJORAS EN O RELACIONADAS CON LA PRODUCCION DE PROTEINAS.

Un método para producir una proteína de mamí-fero glucosilada exógena que comprende al menos un resto de ácido siálico en una célula briofítica transformada,

5 que comprende: i) introducir en una célula briofítica seis secuen-cias de ácido nucleico aisladas, que comprenden cada una una secuencia de ácido nucleico operablemente en-10 lazada a un promotor exógeno que conduce la expresión en una célula briofítica, en el que las dichas seis secuencias de ácido nucleico aisladas codifican seis proteínas funcionales que son expresadas en la célula briofítica, en el que las mencionadas seis proteínas 15 funcionales son una UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa de mamífero, una ácido N-acetilneuramínico fosfato sintasa (ácido siálico sintasa) de mamífero, una ácido CMP-N-acetilneuramínico sintasa de mamífero, un transporta-20 dor de ácido CMP-siálico de mamífero, una galactosil-transferasa, y una sialiltransferasa de mamífero; o usar una célula briofítica que ya se ha transformado y es capaz de expresar dichas seis proteínas funcio-nales; y 25 ii) introducir en dicha célula una secuencia de ácido nucleico aislada adicional que comprende una secuen-cia de ácido nucleico operablemente enlazada a un promotor exógeno que conduce la expresión en una célula briofítica, en el que dicha secuencia de ácido 30 nucleico codifica dicha proteína de mamífero exógena; o usar una célula briofítica que ya se ha transforma-do y es capaz de expresar dicha proteína de mamífero exógena; y, opcionalmente, iii) recuperar, purificar o aislar dicha proteína de mamífero glucosilada que comprende al menos un resto de ácido siálico a partir de dicha célula briofítica. 5

Antecedentes

La presente invención se refiere a un método para 5 producir proteínas glucosiladas heterólogas en células briofíticas transformadas. En particular, el método se refiere a un método para producir proteínas glucosiladas, que comprende patrones de glucosilación animal – que com-prenden restos de ácido siálico -, tales como proteínas 10 farmacéuticas para uso en mamíferos, por ejemplo seres humanos, en células briofíticas tales como las de Physco-mitrella patens; al material genético requerido para ello, tal como ADN y ARN, vectores, células hospedantes; a métodos para introducir material genético allí dentro; 15 y a sus usos. Adicionalmente, la presente invención se refiere a nuevos polipéptidos y proteínas obtenidos me-diante el método según la invención. Además, la presente invención proporciona un método para producir ácido siá-lico o CMP-ácido siálico en una célula briofítica, tejido 20 u organismo transformado.

Las plantas son organismos apropiados para la pro-ducción de un amplio intervalo de proteínas recombinantes (Ma et al. (2003) Nat Gen 4, 794-805). En términos de proteínas farmacéuticas para uso en mamíferos, incluyendo 25 seres humanos, a menudo se requieren modificaciones post-traduccionales, tales como la glucosilación. Sin embargo, un problema encontrado en sistemas de células eucariotas que se han transformado con genes heterólogos adecuados para la producción de secuencias proteicas destinadas pa-30 ra uso, por ejemplo, como fármacos en seres humanos, es que el patrón de glucosilación en tales proteínas adquie-

re a menudo un patrón nativo, esto es, el sistema de células eucariotas en el que se ha introducido la proteí-na: se producen proteínas glucosiladas que comprenden pa-trones de glucosilación no animales, es decir, por ejem-plo, no mamíferos, y estos a su vez pueden ser inmunogé-5 nicos y/o alergénicos si se aplica en animales, tales co-mo mamíferos, por ejemplo seres humanos.

Comparadas con las glucoproteínas derivadas de mamíferos, las glucoproteínas específicas de plantas con-tienen dos restos adicionales. En el pasado, el uso de 10 glucoproteínas recombinantes producidas por plantas esta-ba limitado por la N-glucosilación específica de plantas que se adquiere en tales proteínas. En el caso de briófi-tos, Koprivova et al. ((2004), Plant Biotechnol J 2, 517-523), y en el caso de semillas de plantas, Strasser et 15 al. ((2004) FEBS Lett. 561, 132-136)) tuvieron éxito en superar esta limitación usando diferentes enfoques. Las plantas generadas en los dos estudios mostraron una N-glucosilación compleja que carece de los dos restos de azúcar específicos de plantas mencionados anteriormente. 20

Además, en las plantas no se encuentran los restos de beta 1,4-galactosa terminales de glucoproteínas vege-tales, indicando que una beta 1,4-galactosiltransferasa no está presente en las plantas. Se ha descrito la inte-gración estable y expresión de esta enzima en plantas de 25 tabaco (Bakker et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98 , 2899-2904), en células BY2 del tabaco (Palacpac et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96, 4692-4697) así como en briófitos haploides gametofíticos (Huether et al. (2005) Plant Biol 7, 292-299). La beta 1,4-galactosiltransferasa 30 humana recombinante fue funcional, y las proteínas aisla-das del material transgénico mostraron restos de beta

1,4-galactosa terminales.

La presente invención se refiere a la mejora adi-cional de métodos existentes a fin de asegurar que se producen polipéptidos y proteínas con una funcionalidad aún más mejorada en animales, tales como mamíferos. 5

Las estructuras de N-glucano más complejas presen-tes en proteínas de mamíferos, incluyendo proteínas de seres humanos, contienen ácidos siálicos como restos de azúcar terminales. Aunque la presencia de glucoconjugados sialilados en células cultivadas en suspensión no trans-10 génicas de Arabidopsis thaliana fue descrita recientemen-te por Shah et al. ((2003) Nat Biotechnol 21, 1470-1471), estos resultados están bajo discusión (Seveno et al. (2004) Nat Biotechnol 11, 1351-1353).

Sin embargo, la técnica anterior no proporciona 15 ninguna información sobre si la sialilación también tiene lugar en briófitos y puede permitir la expresión recombi-nante de glucoproteínas heterólogas que tienen las carac-terísticas de N-glucano deseadas. Además, no existen da-tos en la técnica anterior en cuanto a la existencia pura 20 de ácido siálico en ningún briófito.

Un requisito previo para la sialilación en N-glucanos es la presencia de ácido neuroamínico activado (CMP NeuAc). En mamíferos, diferentes enzimas están im-plicadas en la síntesis de NeuAc (ácido siálico) – el 25 precursor de CMP NeuAc. La UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa (número de acceso Genbank: AF155663) es responsable de la generación de ManNAc-6P que es procesado por la ácido N-acetilneuramínico fosfato sintasa (número de acceso Gen-30 bank: NM_018946) en NeuAc-9P. La enzima responsable del procesamiento de NeuAc-9P en NeuAc no se ha descrito has-

ta ahora. La activación de NeuAc tiene lugar en el núcleo de células de mamíferos. La enzima CMP-ácido N-acetilneuramínico sintasa (número de acceso Genbank: NM_018686) es la responsable de la generación del ácido siálico activado (CMP NeuAc). El producto activado se ha 5 de mover desde el núcleo al aparato de Golgi – en este proceso está implicado el transportador de CMP-ácido siá-lico (número de acceso Genbank: NM_006416). Finalmente, la sililación en N-glucanos tiene lugar mediante la transferencia de CMP NeuAc sobre restos de azúcar termi-10 nales - por ejemplo restos de galactosa enlazados 1,4. A este fin, se ha de asegurar la expresión de una sialil-transferasa (por ejemplo, alfa-2,6 sialiltransferasa; número de acceso NM_003032, Genebank). El briófito Phys-comitrella patens, una planta del suelo no vascular 15 haploide, es capaz de ser usado para la producción de proteínas recombinantes (documento WO 01/25456).

El ciclo de vida de los briófitos está dominado por la generación gametocítica fotoautotrófica. El ciclo de vida es completamente diferente del de las plantas supe-20 riores, en las que el esporofito es la generación domi-nante y hay notablemente muchas diferencias a observar entre plantas superiores y briófitos.

El gametofito de los briófitos se caracteriza por dos etapas de desarrollo distintas. El protonema, que se 25 desarrolla vía crecimiento apical, crece en una red fila-mentosa de sólo dos tipos celulares (células cloronémicas y caulonémicas). La segunda etapa, denominada gametoforo, se diferencia por el crecimiento caulinar a partir de un sistema apical simple. Ambas etapas son fotoautotrófica-30 mente activas. Se ha demostrado el cultivo de protonema sin diferenciación en el gametoforo más complejo para

cultivos en suspensión en matraces así como para cultivos en biorreactores (documento WO 01/25456). El cultivo de tejido multicelular completamente diferenciado y fotoau-totróficamente activo que contiene sólo unos pocos tipos de células no está descrito para plantas superiores. La 5 estabilidad genética del sistema celular briofítico pro-porciona una ventaja importante con respecto a los culti-vos de células vegetales. En cultivos celulares de plan-tas superiores, el metabolismo secundario está más dife-renciado, y esto da como resultado diferencias en los 10 perfiles de metabolitos secundarios.

Además hay algunas diferencias importantes entre briófitos y plantas superiores a nivel bioquímico. La asimilación de sulfato en Physcomitrella patens difiere de aquella en plantas superiores. La enzima clave de la 15 asimilación del sulfato en plantas superiores es adenosi-na 5'-fosfosulfato reductasa. En Physcomitrella patens, coexiste una ruta alternativa vía fosforadenosina 5'-fosfosulfato reductasa (Koprivova et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 32195-32201). Esta ruta no se ha caracterizado 20 en plantas superiores.

Otras diferencias se reflejan en la regeneración de la pared celular. Los protoplastos derivados de plantas superiores regeneran nuevas paredes celulares de manera rápida, independientemente del medio de cultivo. La 25 transferencia directa de ADN vía polietilenglicol (PEG) en protoplastos de plantas superiores requiere la prein-cubación a 4 a 10ºC para ralentizar el proceso de la re-generación de la pared celular (patente US 5.508.184). Por el contrario, la regeneración de la pared celular de 30 protoplastos derivados de...

Reivindicaciones

1. Un método para producir una proteína de mamí-fero glucosilada exógena que comprende al menos un resto de ácido siálico en una célula briofítica transformada, 5 que comprende:

i) introducir en una célula briofítica seis secuen-cias de ácido nucleico aisladas, que comprenden cada una una secuencia de ácido nucleico operablemente en-10 lazada a un promotor exógeno que conduce la expresión en una célula briofítica, en el que las dichas seis secuencias de ácido nucleico aisladas codifican seis proteínas funcionales que son expresadas en la célula briofítica, en el que las mencionadas seis proteínas 15 funcionales son una UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa de mamífero, una ácido N-acetilneuramínico fosfato sintasa (ácido siálico sintasa) de mamífero, una ácido CMP-N-acetilneuramínico sintasa de mamífero, un transporta-20 dor de ácido CMP-siálico de mamífero, una galactosil-transferasa, y una sialiltransferasa de mamífero; o usar una célula briofítica que ya se ha transformado y es capaz de expresar dichas seis proteínas funcio-nales; y 25

ii) introducir en dicha célula una secuencia de ácido nucleico aislada adicional que comprende una secuen-cia de ácido nucleico operablemente enlazada a un promotor exógeno que conduce la expresión en una célula briofítica, en el que dicha secuencia de ácido 30 nucleico codifica dicha proteína de mamífero exógena; o usar una célula briofítica que ya se ha transforma-

do y es capaz de expresar dicha proteína de mamífero exógena; y, opcionalmente,

iii) recuperar, purificar o aislar dicha proteína de mamífero glucosilada que comprende al menos un resto de ácido siálico a partir de dicha célula briofítica. 5

2. El método según la reivindicación 1, en el que la galactosiltransferasa es una beta-1,4 galactosil-transferasa, preferiblemente una beta 1,4 galactosil-transferasa humana. 10

3. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la sialiltransferasa es una alfa-2,6 o alfa-2,3 sialiltransferasa.

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se usa una célula briofítica 15 en la que la actividad de fucosiltransferasa y/o xilosil-transferasa está significativamente reducida o eliminada.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la célula briofítica trans-formada es una célula de Physcomitrella patens. 20

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la célula briofítica trans-formada está comprendida en un briófito, o una parte de briófito, o un extracto o derivado de un briófito, o en un cultivo celular de briófito. 25

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la proteína de mamífero glu-cosilada es una proteína humana.

8. El método según la reivindicación 7, en el que la proteína se selecciona del grupo que consiste en 30 VEGF, interferones tales como alfa-interferón, beta-interferón, gamma-interferón, factores de coagulación de

la sangre seleccionados de Factor VII, VIII, IX, X, XI, y XII, hormonas de la fertilidad, incluyendo hormona lutei-nizante, hormona estimuladora de folículo, factores de crecimiento, incluyendo el factor de crecimiento epidér-mico, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el 5 factor estimulador de colonias granulocíticas, prolacti-na, oxitocina, hormona estimuladora del tiroides, hormona adrenocorticotrópica, calcitonina, hormona paratiroidea, somatostatina, eritropoyetina (EPO), enzimas, tales como beta-glucocerebrosidasa, proteínas de fusión, tales como 10 la proteína de fusión del dominio de unión al ligando del receptor de TNF alfa con la porción Fc de IgG, recepto-res, proteínas de superficie, proteínas transmembránicas, anticuerpos monoclonales, y fragmentos fisiológicamente activos de los mismos. 15

9. Un método para producir ácido siálico o ácido CMP-siálico en una célula, tejido u organismo briofítico transformado, que comprende

i) transformar dicha célula, tejido u organismo 20 briofítico con tres secuencias polinucleotídicas que codifican tres polipéptidos que son una UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa de mamífero, una ácido N-acetilneuramínico fosfato sintasa (ácido siálico sintasa) de mamífero, 25 y una ácido CMP-N-acetilneuramínico sintasa de mamí-fero; o

ii) usar una célula, tejido u organismo briofítico ya transformado que comprende tres secuencias polinucle-otídicas que codifican tres polipéptidos que son una 30 UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa de mamífero, una ácido N-

acetilneuramínico fosfato sintasa (ácido siálico sin-tasa) de mamífero, y una ácido CMP-N-acetilneuramínico sintasa de mamífero; y, opcional-mente,

iii) recuperar, purificar o aislar el ácido siálico o 5 ácido CMP-siálico de la célula, tejido u organismo como se trata o define en i) y/o ii).

10. Una célula briofítica transformada que com-prende seis secuencias nucleotídicas heterólogas cada una 10 enlazada operablemente a un promotor exógeno que conduce la expresión en la mencionada célula briofítica en la que las mencionadas seis secuencias nucleotídicas codifican seis proteínas funcionales que son expresadas en la célu-la briofítica, en la que dichas seis proteínas funciona-15 les son una UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa de mamífero, una ácido N-acetilneuramínico fosfato sintasa (ácido siálico sintasa) de mamífero, una ácido CMP-N-acetilneuramínico sintasa de mamífero, un transportador de ácido CMP-siálico de mamí-20 fero, una galactosiltransferasa, y una sialiltransferasa de mamífero.

11. Una célula briofítica transformada según la reivindicación 10, en la que las mencionadas secuencias de ácido nucleico son secuencias de mamífero, preferible-25 mente secuencias de ácido nucleico de ser humano.

12. Una célula briofítica transformada según la reivindicación 10 u 11, en la que la galactosiltransfera-sa es una beta-1,4 galactosiltransferasa, preferiblemente una secuencia nucleotídica de beta 1,4 galactosiltransfe-30 rasa humana.

13. Una célula briofítica transformada según una

cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en la que la sialiltransferasa se selecciona de una alfa-2,6 o alfa 2,3 sialiltransferasa, y es preferiblemente una secuencia nucleotídica de alfa-2,6 sialiltransferasa humana.

14. Una célula briofítica transformada según una 5 cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en la que la actividad de fucosiltransferasa y/o xilosiltransferasa está significativamente reducida o eliminada.

15. Una célula briofítica transformada según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, que es una 10 célula de Physcomitrella patens.

16. Una célula briofítica transformada según la reivindicación 15, que está compuesta de tejido de proto-nema de Physcomitrella patens.