MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN SIMULTÁNEA DE MÚLTIPLES PROTEÍNAS; VECTORES Y CÉLULAS PARA SU USO EN EL MISMO.

Célula que comprende dos unidades de expresión de proteínas que codifican cada una para al menos una proteína de interés,

caracterizada por que: una de dichas unidades de expresión de proteínas comprende al menos una secuencia de antirrepresor de estabilización (STAR) elegida del grupo que consiste en (a) SEQ ID: 7 en la figura 6; (b) una secuencia derivada de SEQ ID: 7 en la figura 6 mediante deleción, modificación y/o inserción de una base; y (c) un fragmento funcional de SEQ ID: 7 en la figura 6; y en la que la otra unidad de expresión de proteínas comprende al menos una secuencia de antirrepresor de estabilización (STAR) elegida del grupo que consiste en: (a) SEQ ID: 1-65 en la figura 6; (b) una secuencia derivada de SEQ ID: 1-65 en la figura 6 mediante deleción, modificación y/o inserción de una base; y (c) un fragmento funcional de SEQ ID: 1-65 en la figura 6

La invención se refiere a los campos de bioquímica, biología molecular, farmacología y diagnóstico. Más específicamente, la presente invención se refiere a la producción de proteínas en una célula hospedadora. Incluso más específicamente, la invención se refiere a un método para mejorar la expresión de dos o más proteínas en una célula (hospedadora). El método es adecuado para la producción de por ejemplo anticuerpos recombinantes que pueden usarse en una preparación farmacéutica o como herramienta de diagnóstico.

Se producen proteínas en sistemas para una amplia gama de aplicaciones en biología y biotecnología. Éstas incluyen investigación de la función celular y molecular, producción de proteínas como productos biofarmacéuticos o reactivos de diagnóstico, y modificación de los rasgos o fenotipos de ganado y cosechas. Los productos biofarmacéuticos son habitualmente proteínas que tienen una función extracelular, tales como anticuerpos para inmunoterapia u hormonas o citocinas para producir una respuesta celular. Las proteínas con funciones extracelulares salen de la célula a través de la ruta secretora, y experimentan modificaciones postraduccionales durante la secreción. Las modificaciones (principalmente glicosilación y formación de enlaces disulfuro) no se producen en bacterias. Además, los oligosacáridos específicos unidos a las proteínas mediante enzimas de glicosilación son específicos de especie y tipo celular. Estas consideraciones limitan a menudo la elección de células hospedadoras para la producción de proteínas heterólogas a células eucariotas (Kaufman, 2000). Para la expresión de proteínas terapéuticas humanas, células hospedadoras tales como bacterias, levaduras o plantas pueden ser inapropiadas. Incluso las diferencias sutiles en glicosilación de proteínas entre roedores y humanos, por ejemplo, puede ser suficiente para hacer que las proteínas producidas en células de roedor sean inaceptables para uso terapéutico (Sheeley et al., 1997). Las consecuencias de la glicosilación inapropiada (es decir, no humana) incluyen inmunogenicidad, reducción de la semivida funcional y pérdida de actividad. Esto limita la elección de las células hospedadoras adicionalmente a líneas celulares humanas o a líneas celulares tales como células de ovario de hámster chino (CHO), que pueden producir glicoproteínas con estructuras de hidratos de carbono de tipo humano (Liu, 1992).

Algunas proteínas de interés biotecnológico son funcionales como multímeros, es decir, consisten en dos o más cadenas polipeptídicas, posiblemente diferentes, en su forma biológica y/o biotecnológicamente activa. Los ejemplos incluyen anticuerpos (Wright y Morrison, 1997), proteínas morfogenéticas óseas (Groeneveld y Burger, 2000), receptores de hormonas nucleares (Aranda y Pascual, 2001), receptores de superficie celular heterodiméricos (por ejemplo, receptores de células T, (Chan y Mak, 1989)), integrinas (Hynes, 1999) y la familia de hormonas de glicoproteína (gonadotropina coriónica, hormona luteinizante hipofisaria, hormona foliculoestimulante y hormona estimulante del tiroides (Thotakura y Blithe, 1995)). La producción de tales proteínas multiméricas en sistemas heterólogos es técnicamente difícil debido a varias limitaciones de los sistemas de expresión actuales. Estas limitaciones incluyen (1) dificultades en el aislamiento de líneas celulares/células recombinantes que producen los polipéptidos de monómeros a altos niveles (previsibilidad y rendimiento) (2) dificultades para lograr la producción de los polipéptidos monoméricos en proporciones estequiométricamente equilibradas (Kaufman, 2000), y (3) disminuciones en los niveles de expresión durante el ciclo de producción industrial de las proteínas (estabilidad). Estos problemas se describen en más detalle a continuación.

(1) Es necesario producir en grandes cantidades proteínas recombinantes tales como anticuerpos que se usan como compuestos terapéuticos. Las células hospedadoras usadas para la producción de proteínas recombinantes deben ser compatibles con la escala de los procesos industriales que se emplean. Específicamente, es necesario que el sistema de expresión transgénica (o el gen que codifica para una proteína de interés, las dos expresiones se usan de manera intercambiable en el presente documento) usado para la proteína heteróloga sea retenido por las células hospedadoras en una forma estable y activa durante las fases de crecimiento del aumento a escala y producción. Esto se logra mediante la integración del transgén en el genoma de la célula huésped. Sin embargo, la creación de líneas celulares recombinantes por medios convencionales es un proceso costoso e ineficaz debido a la impredicibilidad de la expresión transgénica entre las células hospedadoras recombinantes. La impredicibilidad surge de la alta probabilidad de que el transgén se inactive debido a silenciamiento génico (McBurney et al., 2002). Usando tecnologías convencionales, la proporción de células hospedadoras recombinantes que producen un polipéptido a altos niveles oscila desde el 1-2%. Con el fin de construir una línea celular que produce dos polipéptidos a altos niveles, los dos transgenes están generalmente integrados de manera independiente. Si los dos transgenes se transfectan simultáneamente en dos plásmidos separados, la proporción de células que producirán ambos polipéptidos a altos niveles será el producto aritmético de las proporciones para transgenes individuales. Por tanto, la proporción de tales líneas celulares recombinantes oscila desde uno en 2.500 hasta uno en 10.000. Para proteínas multiméricas con tres o más subunidades, las proporciones disminuyen adicionalmente. Estas líneas celulares de alta producción deben identificarse y aislarse posteriormente del resto de la población. Los métodos requeridos para seleccionar estas líneas celulares de alta expresión raras son caros y consumen mucho tiempo.

Una alternativa a la transfección simultánea de dos plásmidos que portan un transgén es la transfección secuencial. En este caso, la proporción de clones de alto rendimiento será la suma de las proporciones para transgenes individuales, es decir, el 2-4%. Sin embargo, la transfección secuencial tiene desventajas (importantes), incluyendo

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alto coste y escasa estabilidad. El alto coste resulta de diversos factores: en particular, el tiempo y los recursos requeridos para seleccionar líneas celulares de alta expresión se duplican, puesto que la alta expresión de cada subunidad debe seleccionarse por separado. La escasa estabilidad global de las células hospedadoras que expresan dos polipéptidos es una consecuencia de la inestabilidad inherente de cada uno de los dos transgenes.

(2) La producción de proteínas multiméricas requiere niveles equilibrados de expresión transcripcional y traduccional de cada uno de los monómeros de polipéptido. La expresión desequilibrada de los monómeros desperdicia los costosos recursos usados en el cultivo celular. Además, la expresión desequilibrada de un monómero puede tener efectos perjudiciales sobre la célula. Estos efectos incluyen (a) el secuestro de factores celulares requeridos para la secreción de las proteínas recombinantes (por ejemplo chaperonas en el retículo endoplasmático, (Chevet et al., 2001)), y (b) inducción de respuestas al estrés que dan como resultado tasas reducidas de crecimiento y traducción de proteínas, o incluso apoptosis (muerte celular programada) (Pahl y Baeuerle, 1997, Patil y Walter, 2001). Estos efectos perjudiciales conducen a pérdidas de productividad y rendimiento y a mayores costes indirectos.

(3) El silenciamiento de la expresión transgénica durante el cultivo prolongado de células hospedadoras es un fenómeno comúnmente observado. En células de vertebrados, puede producirse mediante la formación de heterocromatina en el locus del transgén, lo que impide la transcripción del transgén. El silenciamiento del transgén es estocástico; puede producirse poco después de la integración del transgén en el genoma, o sólo tras varias divisiones celulares. Esto da como resultado poblaciones celulares heterogéneas tras el cultivo prolongado, en el que algunas células continúan expresando altos niveles de proteína recombinante mientras que otras expresan niveles bajos o indetectables de la proteína (Martin y Whitelaw, 1996, McBurney et al., 2002). Una línea celular que se usa para la producción de proteínas heterólogas se deriva de una célula individual, aunque a menudo se aumenta a escala hasta, y se mantiene durante largos periodos... [Seguir leyendo]

1. Célula que comprende dos unidades de expresión de proteínas que codifican cada una para al menos una proteína de interés, caracterizada por que:

una de dichas unidades de expresión de proteínas comprende al menos una secuencia de antirrepresor de estabilización (STAR) elegida del grupo que consiste en (a) SEQ ID: 7 en la figura 6; (b) una secuencia derivada de SEQ ID: 7 en la figura 6 mediante deleción, modificación y/o inserción de una base; y (c) un fragmento funcional de SEQ ID: 7 en la figura 6; y en la que la otra unidad de expresión de proteínas comprende al menos una secuencia de antirrepresor de estabilización (STAR) elegida del grupo que consiste en: (a) SEQ ID: 1-65 en la figura 6; (b) una secuencia derivada de SEQ ID: 1-65 en la figura 6 mediante deleción, modificación y/o inserción de una base; y (c) un fragmento funcional de SEQ ID: 1-65 en la figura 6.

2. Célula según la reivindicación 1, en la que dichas dos unidades de expresión de proteínas codifican cada una además para un marcador de selección diferente.

3. Célula según la reivindicación 1 ó 2, en la que al menos una de dichas unidades de expresión de proteínas comprende un gen monocistrónico que comprende un marco de lectura abierto que codifica para una proteína de interés y en la que dicho gen monocistrónico está bajo el control de un promotor funcional.

4. Célula según la reivindicación 1 ó 2, en la que al menos una de dichas unidades de expresión de proteínas comprende un gen bicistrónico que comprende en el siguiente orden: (i) un marco de lectura abierto que codifica para una proteína de interés, (ii) un sitio de entrada interna del ribosoma (IRES), y (iii) un marcador de selección, y en la que dicho gen bicistrónico está bajo el control de un promotor funcional.

5. Célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que al menos una de dichas unidades de expresión de proteínas comprende al menos dos de dichas secuencias STAR dispuestas de manera que dicha unidad de expresión de proteínas está flanqueada en cada lado por al menos una de dichas secuencias STAR.

6. Célula según la reivindicación 5, en la que dichas al menos dos secuencias STAR son esencialmente idénticas.

7. Célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que al menos una proteína de interés comprende una cadena pesada de inmunoglobulina, o una cadena ligera de inmunoglobulina, y preferiblemente en la que al menos una proteína de interés comprende una cadena pesada de inmunoglobulina y la otra proteína de interés comprende una cadena ligera de inmunoglobulina, en la que dicha cadena pesada y ligera puede formar un anticuerpo funcional.

8. Método para expresar al menos dos proteínas de interés en una célula, que comprende cultivar una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en condiciones en las que se expresan dichas unidades de expresión de proteínas.

9. Unidad de expresión de proteínas que comprende:

- un gen bicistrónico que comprende en el siguiente orden: (i) un marco de lectura abierto que codifica para una proteína de interés, (ii) un sitio de entrada interna del ribosoma (IRES), y (iii) un marcador de selección, y en la que dicho gen bicistrónico está bajo el control de un promotor funcional; y

- al menos una secuencia STAR elegida del grupo que consiste en: (a) SEQ ID: 7 en la figura 6; (b) a) una secuencia derivada de SEQ ID: 7 en la figura 6 mediante deleción, modificación y/o inserción de una base; y (c) un fragmento funcional de SEQ ID: 7 en la figura 6.

10. Unidad de expresión de proteínas según la reivindicación 9, que comprende al menos dos de dichas secuencias STAR dispuestas de manera que dicha unidad de expresión de proteínas está flanqueada en cada lado por al menos una de dichas secuencias STAR.

11. Unidad de expresión de proteínas según la reivindicación 10, en la que dichas al menos dos secuencias STAR son esencialmente idénticas.

12. Unidad de expresión de proteínas según una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en la que dicha proteína de interés es una cadena pesada de inmunoglobulina o una cadena ligera de inmunoglobulina.