Procedimiento para producir un homogeneizado seco estable de una planta transgénica que expresa una proteína anticonceptiva heteróloga,

que comprende: a) obtener material vegetal transgénico intacto o dividido que expresa una proteína anticonceptiva heteróloga fusionada con una proteína de direccionamiento mucoso, b) deshidratar dicho material vegetal transgénico; c) mezclar dicho material vegetal transgénico en un homogeneizado antes o después de dicha etapa de deshidratación; y d) añadir un adyuvante a dicho homogeneizado

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a técnicas de tratamiento para la producción de proteínas farmacéuticamente activas, tales como vacunas, anticuerpos u otros compuestos terapéuticos derivados de plantas transgénicas, así como a su administración a seres humanos y animales para la inmunoanticoncepción, la vacunación contra enfermedades 5 patogénicas, o el tratamiento terapéutico contra la infección por otros compuestos inmunorreactivos. El desarrollo de vacunas a base de plantas ha desarrollado significativamente los enfoques disponibles de vacunación de seres humanos y animales. La utilización de plantas transgénicas para el desarrollo de vacunas, anticuerpos y otros compuestos terapéuticos humanos y veterinarios no sólo ha incrementado la eficiencia de la producción de proteínas terapéuticas, sino que ha reducido asimismo sustancialmente los costes primarios de producción. 10

Con respecto a la producción de vacunas a base de plantas, se han realizado avances significativos en la expresión de proteínas en plantas transgénicas. Por ejemplo, se han utilizado diversas formas, agregados o fusiones de expresión para incrementar la producción de subunidades de vacuna, anticuerpos y proteínas terapéuticas o anticonceptivas, tal como se describe en las patentes US nº 5.679.880, nº 5.484.719, nº 5.686.079 y en la solicitud de patente US 2002/0006411. Sin embargo, el estado actual de la tecnología de vacunas de plantas transgénicas todavía 15 requiere que la proteína farmacéutica se purifique respecto del material vegetal transgénico, o que sean consumidos los tejidos vegetales no tratados crudos estandarizados. Desafortunadamente, estas opciones para la producción de productos farmacéuticos administrables derivados de plantas presentan desventajas inherentes.

El producto farmacéutico derivado de planta preferido es el tejido vegetal estandarizado que pueda administrarse por vía oral. Más específicamente, resulta preferido que el material vegetal pueda almacenarse, 20 transportarse y administrarse a temperatura ambiente. Sin embargo, las vacunas a bae de plantas transgénicas no purificadas presentan los problemas inherentes siguientes: i) los niveles variables de expresión de proteínas observados de una planta a otra, e ii) el carácter perecedero, por lo tanto la degradación de las proteínas. Los productos recién recolectados, tales como frutos, tubérculos, raíces, hojas o cualquier otro tejido vegetal, se encuentran limitados debido a su vida de almacenamiento relativamente corta en comparación con los requisitos 25 farmacéuticos convencionales. Además, el nivel variable de acumulación de las proteínas transgénicas observado entre diferentes plantas, clones o tejidos vegetales plantea una dificultad significativa para conseguir una consistencia de las dosis, la cual resulta necesaria para la aplicación farmacéutica.

La tecnología farmacéutica convencional proporciona procedimientos para la extracción, purificación y concentración de las proteínas farmacéuticas; sin embargo, esto resulta caro, supone la necesidad de refrigeración del 30 producto purificado, y no permite el encapsulado protector de la proteína transgénica por la propia célula vegetal. De esta manera, existe una necesidad en la técnica de procedimientos de producción de productos farmacéuticos a base de plantas transgénicas estables que eviten la desventaja de la expresión variable de las proteínas observada de una planta a otra, y que tampoco requieran una purificación adicional respecto del material vegetal original. Los procedimientos de tratamientos descritos en la presente memoria proporcionan un modo de producir a temperatura 35 ambiente una formulación homogénea estable que puede utilizarse en una amplia gama de aplicaciones. Además, el homogeneizado estable a temperatura ambiente presenta las propiedades inherentes de que puede agruparse y realizarse un control de calidad del mismo por lotes. Además, los procedimientos descritos de tratamiento de plantas transgénicas permiten la adición conveniente de adyuvantes, tampones, antioxidantes, estabilizadores o polvos antigénicos durante todo el tratamiento, permitiendo producir una amplia diversidad de formulaciones farmacéuticas de 40 manera eficiente y rentable. Los homogeneizados secos estables pueden utilizarse no sólo para la vacunación y el tratamiento de enfermedades patogénicas, sino que también pueden utilizarse para bloquear la fertilización.

La fertilización es una interacción compleja entre moléculas reguladoras clave sobre la superficie de espermatozoide y óvulo. El papel vital que estas moléculas desempeñan en el proceso reproductor las convierte en dianas para el control de la fertilidad en especies de mamífero. 45

Todos los óvulos de mamífero se encuentran circundados por una zona pelúcida, una cubierta relativamente simple compuesta de tres glucoproteínas (ZP1, ZP2 y ZP3) que proporcionan el receptor de espermatozoide al óvulo. La zona pelúcida de algunas especies no de mamífero también incluye una cuarta glucoproteína, ZP4. Los componentes glucoproteicos de la zona pelúcida presentan funciones específicas durante la fertilización y el desarrollo temprano que han sido bien definidas en el ratón. ZP1 es una proteína estructural que entrecruza filamentos de ZP2 y 50 ZP3. Durante la fertilización, el espermatozoide se une inicialmente a ZP3, que induce la reacción acrosómica del espermatozoide. Tras la inducción acrosómica, ZP2 actúa como receptor secundario del espermatozoide, resultando necesario para la penetración del espermatozoide a través de la zona pelúcida. Tras la fertilización, se cree que el corte proteolítico de ZP2 y la modificación de ZP3 se encuentran implicados en la evitación de la polispermia.

El importante papel de la zona pelúcida durante la fertilización, su expresión única en los oocitos en 55 crecimiento y su fuerte inmunogenicidad la han convertido en una diana atractiva para el desarrollo de vacunas inmunoanticonceptivas (revisión en Epifano y Dean, Reprod. Fertil Dev. 6:319, 1994). Se ha demostrado que la inmunización con zonas enteras o con componentes de la zona pelúcida inhibe la fertilización en varias especies, entre ellas primates, conejos, roedores y perros (revisión de Prasad et al., J. Reprod. Fertil. supl. 50:143, (1996). Aunque las composiciones indicadas en dichas referencias pueden inhibir la fertilización, deben administrarse parenteralmente 60

mediante dardos o inyección, y de esta manera no resultan prácticos para un uso generalizado y económico. Las composiciones indicadas en dichas referencias, en contraste con la presente invención, no pudieron administrarse eficazmente por vía oral en forma de cebo crudo, alimento o material tratado para el consumo digestivo.

Fitchen et al. (Vaccine 13:1051, 1995) intentaron producir proteínas anticonceptivas en plantas para la administración purificada en especies animales diana o de modelo mediante inyección. En este ejemplo, se manipuló 5 un epítopo de ZP3 murino dentro de la secuencia de la proteína de cubierta del virus del mosaico del tabaco (TMV) y se expresó en la planta del tabaco durante la infección por el TMV. Las partículas víricas (que expresaban el epítopo de ZP sobre la superficie exterior del virus) se purificaron crudamente a partir del material vegetal para la administración parenteral. Sin embargo, las partículas víricas no resultaron efectivas para reducir el tamaño de la camada en el modelo de ratón. Fitchen et al. no se refieren a un procedimiento para inducir la anticoncepción en un animal, o a la 10 administración oral de un planta transgénica en el animal, en la que la administración oral reduce el tamaño de camada medio en por lo menos 50%.

Existe una necesidad en la técnica de una composición vegetal que pueda administrarse convenientemente por vía oral en un animal en forma de un cebo crudo, o como alimento para el consumo digestivo, y que reduzca significativamente el tamaño de camada de los animales en los que se administre. Existe una necesidad de la técnica 15 de evitar el uso de virus vegetales para la expresión. Por lo tanto, existe una necesidad de la técnica para expresar proteínas anticonceptivas directamente por parte de las células vegetales mismas, proporcionando de esta manera una respuesta inmunológica de la mucosa tras el consumo del material vegetal por parte de un animal.

Mientras la población humana estimada continúe expandiéndose más allá del número de los 6 mil millones, la distribución poblacional de otras especies salvajes continuará... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para producir un homogeneizado seco estable de una planta transgénica que expresa una proteína anticonceptiva heteróloga, que comprende:

a) obtener material vegetal transgénico intacto o dividido que expresa una proteína anticonceptiva heteróloga fusionada con una proteína de direccionamiento mucoso, 5

b) deshidratar dicho material vegetal transgénico;

c) mezclar dicho material vegetal transgénico en un homogeneizado antes o después de dicha etapa de deshidratación; y

d) añadir un adyuvante a dicho homogeneizado. 10

2. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la deshidratación se lleva a cabo mediante secado por congelación, secado al aire o secado mediante pulverización de dicho material.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además la etapa que consiste en dividir el material deshidratado antes de dicha etapa de mezcla.

4. Homogeneizado seco estable de una planta transgénica que expresa una proteína anticonceptiva 15 heteróloga fusionada con una proteína de direccionamiento mucoso y que comprende un adyuvante que se puede obtener mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Homogeneizado seco estable que comprende: (i) un material vegetal transgénico deshidratado que contiene una proteína anticonceptiva transgénica fusionada con una proteína de direccionamiento mucoso, e (ii) un adyuvante. 20

6. Composición farmacéutica que comprende el homogeneizado seco estable según la reivindicación 4 ó 5 mezclado con un portador farmacéuticamente aceptable.

7. Procedimiento de anticoncepción, que comprende:

administrar a un animal no humano: (i) un homogeneizado seco estable de un material vegetal transgénico que comprende una molécula de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido anticonceptivo fusionado con una 25 proteína de direccionamiento mucoso, e (ii) un adyuvante, y en el que dicha administración reduce el número medio de descendientes producidos por ciclo reproductivo por dicho animal en por lo menos 50%.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha administración induce una respuesta inmunológica de la mucosa en dicho animal no humano a dicha proteína anticonceptiva.

9. Procedimiento según la reivindicación 7 u 8, en el que dicho ácido nucleico se integra en un cromosoma 30 vegetal.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 ó 9, en el que dicho material vegetal transgénico se selecciona de entre el grupo constituido por hojas, raíces, brotes, tallos, frutos, tubérculos, flores y semillas.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 9 ó 10, en el que el material vegetal 35 transgénico es comestible.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho material vegetal transgénico se selecciona de entre el grupo constituido por hojas, raíces, brotes, tallos, frutos, tubérculos, flores y semillas.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 ó 9 a 12, en el que dicho polipéptido 40 anticonceptivo codificado por dicho ácido nucleico se selecciona de entre el grupo constituido por glucoproteína de zona pelúcida, GnRH, LHRH, LH, LDH y antígenos antiespermáticos.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicha glucoproteína de zona pelúcida se selecciona de entre el grupo constituido por ZP1, ZP2, ZP3 y ZP4.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicha glucoproteína de zona pelúcida es la ZP3. 45

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 ó 9 a 15, en el que dicha proteína anticonceptiva es específica de una especie.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 16, en el que dicha proteína de direccionamiento mucoso es la subunidad B de la enterotoxina de E. coli.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que dicho material vegetal transgénico se administra como una planta completa.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que dicho material vegetal 5 transgénico se administra por vía mucosa.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que dicha administración mucosa es por vía oral, nasal u ocular.

21. Procedimiento para inducir una respuesta inmunológica de la mucosa, que comprende: administrar a un animal no humano: (i) un homogeneizado seco estable de un material vegetal transgénico que comprende una 10 secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido anticonceptivo fusionado con una proteína de direccionamiento mucoso, e (ii) un adyuvante, en el que dicha administración induce una respuesta inmunológica de la mucosa en dicho animal no humano a dicha proteína anticonceptiva, y en el que dicha administración reduce el número medio de descendientes producidos por ciclo reproductivo por parte de dicho animal no humano en por lo menos 50%.

22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que dicho material vegetal 15 transgénico se selecciona de entre el grupo constituido por: hojas, raíces, brotes, tallos, frutos, tubérculos, flores y semillas.

23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que dicho material vegetal transgénico presenta la forma de una planta comestible.

24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el que dicho polipéptido 20 anticonceptivo codificado por dicho ácido nucleico se selecciona de entre el grupo constituido por una glucoproteína de zona pelúcida, GnRH, LHRH, LH, LDH y antígeno antiespermático.

25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el que dicha glucoproteína de zona pelúcida se selecciona de entre el grupo constituido por ZP1, ZP2, ZP3 y ZP4.

26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el que dicha glucoproteína de zona 25 pelúcida es la ZP3.

27. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, en el que dicha proteína anticonceptiva es específica de una especie.

28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27, en el que dicha proteína de direccionamiento mucoso es la subunidad B de la enterotoxina de E. coli. 30

29. Composición que comprende un adyuvante saponina mezclado con un homogeneizado seco estable tratado de un material vegetal transgénico que expresa una proteína anticonceptiva heteróloga fusionada con una proteína de direccionamiento mucoso para la administración oral a un animal no humano, en la que dicha administración reduce el número de descendientes producidos por dicho animal no humano por ciclo reproductivo por dicho animal no humano en por lo menos 50%. 35