Un patrón de ensayo para diagnóstico que comprende:

una solución acuosa de proteína Troponina-I,

y

una matriz que comprende al menos un agente tensioactivo aniónico, siendo dicho agente tensioactivo aniónico polioxietilen(1) lauril sulfato sódico

Estabilización de la troponina cardiaca.

La invención se refiere a una composición estabilizada de proteína troponina cardiaca útil como patrones de control y calibrador en inmunoensayos. En particular, la proteína troponina se estabiliza en una matriz acuosa que contiene al menos un agente tensioactivo aniónico.

Antecedentes de la invención

El complejo de troponina desempeña un papel en la regulación dependiente del calcio de la contracción y relajación del músculo. Existen tres proteínas distintas, o isoformas de troponina, que constituyen el complejo de troponina y que se pueden encontrar tanto en los músculos cardiacos como esqueletales. Dichas proteínas se designan Troponina-I, Troponina-C y Troponina-T. Durante el infarto de miocardio, mueren las células del músculo cardíaco y, en consecuencia, liberan su contenido intracelular, incluyendo las proteínas Troponina en la corriente sanguínea.

El infarto de miocardio es una causa principal de fallecimiento en los países desarrollados. La organización Mundial de la Salud (OMS) desarrolló las directrices para diagnosticar el infarto de miocardio en 1979 (ver Circular, 59:607-609 (1979)). Las directrices de la OMS recomiendan que un diagnóstico de miocardio dependa de la manifestación de dos de tres criterios en concreto. Dichos criterios son: (1) Dolor en el pecho o historia de un episodio cardíaco; (2) Indicación de electrocardiograma del episodio cardíaco; y (3) Niveles elevados de la enzima creatina quinasa.

Millones de personas ingresan en las salas de urgencias todos los años aquejados de dolor en el pecho y no tienen electrocardiogramas sin diagnóstico, lo que dificulta un diagnóstico de episodio cardíaco. La medida de los niveles en circulación de creatina quinasa tienen una especificidad cuestionable en relación con la manifestación de infarto de miocardio ya que la elevación de esta proteína en la sangre podría ser el resultado también de una lesión muscular esqueletal. Se ha demostrado que la Troponina-I y la Troponina-T tienen mayor especificidad debido a la presencia de una forma cardíaco específica de estas proteínas presente únicamente en el corazón. La mayor especificidad de Troponina-I y Troponina-T para el diagnóstico de infarto de miocardio ha llevado al desarrollo de diversos inmunoensayos dirigidos a determinar los niveles de estas proteínas en muestras de sangre de un paciente del que se espera que presente niveles elevados. La bibliografía que demuestra la superior utilidad de troponina se ha traducido en una actualización de la definición de infección miocardial a la fecha de 2000 (que se publicó conjuntamente en el Journal of the American College of Cardiology, 36:959-696 (2000) y en el European Heart Journal, 21:1502-1513- (2000)). Esta definición actualizada hace un mayor hincapié en los biomarcadores para el diagnóstico. Como resultado, los criterios para un infarto de miocardio agudo, en evolución o reciente son la típica elevación y gradual caída (troponina) o una elevación y caída más rápidas (CK-MB) de los marcadores bioquímicos de necrosis miocardial con al menos uno de los siguientes: (a) síndromes isquémicos; (b) desarrollo de ondas Q patológicas en el ECG , (c) cambios en ECG indicativos de isquemia (elevación o depresión del segmento ST); o (d) intervención de la arteria coronaria (v.g., angioplastia coronaria).

Los inmunoensayos cuantitativos requieren el uso tanto de patrones de calibración para definir una curva de calibración como patrones de control para analizar la integridad de la curva de calibración. Una característica necesaria de los patrones utilizados es la estabilidad, es decir, demostrar la pérdida mínima de inmunoactividad a lo largo de un período de tiempo definido (fecha de expiración) en las condiciones de almacenamiento apropiadas. Las técnicas de estabilización para Troponina-I han incluido congelación, liofilización y disolución en agentes de reducción fuertes, como guanidina. Dichas técnicas requieren por lo general un tiempo adicional, un equipo especializado y procedimientos de manejo especiales necesarios para descongelar o reconstituir. Adicionalmente, el descongelado o reconstitución de la proteína troponina tiene como resultado normalmente un material inestable con una vida en almacenamiento limitada.

En US 5834210 se describe un método para la preparación de complejos de Troponina cardiaca humana estables que se obtienen a partir de Troponina-I, modificada recombinante, Troponina-C recombinante y Troponina-T recombinante, en presencia de una sal o sales alcalinotérreas y, si se desea, un detergente como dodecil sulfato sódico.

En WO 96/27661 se describen composiciones para estabilizar proteínas y fragmentos de proteínas, como Troponina y fragmentos de Troponina. Las composiciones comprenden una solución acuosa de un tampón, una proteína estabilizante, un agente quelante, un agente de reducción y una sal y pueden comprender dodecil sulfato como detergente.

Debido a la inestabilidad inherente de la proteína troponina, existe la necesidad de contar con un material que sea resistente a las variaciones de la temperatura a las que se somete potencialmente durante el transporte y el almacenamiento. Existe además la necesidad de contar con un método para preparar dicha troponina estabilizada. La invención proporciona una proteína troponina estabilizada y un método para preparar la troponina estabilizada.

Compendio de la invención

En uno de los modos de realización, la invención proporciona un patrón de ensayo de diagnóstico que comprende una solución acuosa de proteína Troponina-1 y una matriz que comprende al menos un agente tensioactivo aniónico, siendo el agente tensioactivo aniónico en el patrón de ensayo de diagnóstico polioxietilen(1) lauril sulfato sódico.

En otro modo de realización más, el patrón para ensayo de diagnóstico es estable a temperatura ambiente durante al menos seis (6) meses.

En otro modo de realización más, la matriz en el patrón para ensayo de diagnóstico comprende además gelatina porcina.

En otro modo de realización más, la matriz en el patrón para ensayo de diagnóstico comprende además un compuesto seleccionado del grupo que consiste en cloruro sódico y fosfato sódico.

En otro modo de realización, la matriz del patrón para ensayo de diagnóstico comprende además un tampón de pH que se añade para mantener el pH dentro del intervalo de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,2.

En otro modo de realización más, la matriz contiene polioxietilen(1) lauril sulfato sódico en una concentración de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,25%.

En otro modo de realización, la invención proporciona un método para estabilizar Troponina en una solución acuosa, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) preparar una solución acuosa de al menos un agente tensioactivo aniónico, siendo el agente tensioactivo aniónico polioxietilen(1) lauril sulfato sódico;

(b) añadir proteína Troponina-I a la solución acuosa; y

(c) almacenar la solución a temperatura ambiente.

En otro modo de realización más, la invención se refiere a un patrón para ensayo de diagnóstico que comprende una solución acuosa de un complejo de una proteína Troponina-I y una proteína Troponina-C y una matriz que comprende al menos un agente tensioactivo aniónico, siendo el agente tensioactivo aniónico del patrón para ensayo de diagnóstico polioxietilen(1) lauril sulfato sódico.

En otro modo de realización, dicho patrón para ensayo de diagnóstico es estable a temperatura ambiente durante al menos seis (6) meses.

En otro modo de realización más, la matriz del patrón para ensayo de diagnóstico comprende además gelatina porcina.

En otro modo de realización más, la matriz del patrón para ensayo de diagnóstico comprende además un compuesto seleccionado del grupo que consiste en cloruro sódico y fosfato sódico.

En otro modo de realización, la matriz del patrón para ensayo de diagnóstico comprende además un tampón de pH que se añade para mantener el pH dentro del intervalo de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,2.

En otro modo de realización más de este patrón para ensayo de diagnóstico, la matriz contiene polioxietilen(1) lauril sulfato sódico en una concentración de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,25%.

En otro modo de realización, la invención proporciona un método para estabilizar Troponina en una solución...

1. Un patrón de ensayo para diagnóstico que comprende:

una solución acuosa de proteína Troponina-I, y

una matriz que comprende al menos un agente tensioactivo aniónico, siendo dicho agente tensioactivo aniónico polioxietilen(1) lauril sulfato sódico.

2. Un patrón de ensayo para diagnóstico con arreglo a la reivindicación 1 que comprende:

una solución acuosa que contiene un complejo de proteína Troponina-I y Troponina-C; y

una matriz que comprende al menos un agente tensioactivo aniónico, siendo dicho agente tensioactivo aniónico polioxietilen (1) lauril sulfato sódico.

3. Un patrón de ensayo para diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 siendo dicho patrón estable a temperatura ambiente durante al menos seis meses.

4. El patrón de ensayo para diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, comprendiendo dicha matriz además gelatina porcina.

5. El patrón de ensayo para diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 comprendiendo además la matriz un compuesto seleccionado del grupo que consiste en cloruro sódico y fosfato sódico.

6. El patrón de ensayo para diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, comprendiendo dicha matriz además un tampón de pH que se añade para retener el pH dentro del intervalo de 6,8 a 7,2.

7. El patrón de ensayo para diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, encontrándose el polioxietilen (1) lauril sulfato sódico en una concentración comprendida entre 0,1 y 0,25%.

8. Un método para estabilizar Troponina en una solución acusa, comprendiendo dicho método las etapas de:

Preparar una solución acuosa de al menos un agente tensioactivo aniónico, siendo dicho agente tensioactivo aniónico polioxietilen (1) lauril sulfato sódico;

Añadir proteína Troponina-I; y

Almacenar la solución a temperatura ambiente.

9. Un método para estabilizar Troponina en una solución acuosa según la reivindicación 8, comprendiendo dicho método las etapas de:

Preparar una solución acuosa de al menos un agente tensioactivo aniónico, siendo dicho agente tensioactivo aniónico polioxietilen (1) lauril sulfato sódico;

Añadir una proteína Troponina-I y proteína Troponina-C, ya sea por separado o en combinación como un solo complejo, y

Almacenar la solución a temperatura ambiente.