ENSAYO DE INFECTIVIDAD.

Procedimiento para infectar una línea celular diana con un agente EET,

que comprende:

i) formar una preparación de membrana que contiene un agente EET de un primer tipo de célula animal en una primera membrana; y mezclar dicha preparación de membrana con una segunda membrana de un segundo tipo de célula animal; en el que el primer y segundo tipos de células animales son diferentes;

ii) formar una membrana contigua que comprende dicho agente EET y dicha segunda membrana;

iii) poner en contacto dicha línea celular diana con dicha membrana contigua;

y así infectar dicha línea celular diana con dicho agente EET;

en el que la segunda membrana es del mismo tipo de células animal que la de la línea celular diana

Ensayo de infectividad.

La presente invención se refiere a procedimientos para la promoción de la infección de una línea de cultivo celular con un agente EET para generar una línea celular infectadas, preferentemente una línea celular transfectadas de manera estable. La presente invención también se refiere a las utilizaciones de la línea celular infectada para la detección de un agente EET y para el diagnóstico de enfermedades EET, y para la identificación de agentes terapéuticos adecuados para tratar enfermedades EET.

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) son una familia de trastornos neurodegenerativos que incluye la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (ECJ) y Kuru en humanos, la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) en bovinos y tembladera en ovejas. Las EET presentan, como una enfermedad familiar, esporádica o iatrogénica, una frecuencia de aproximadamente 1 caso por millón de población (Will, 1993). Sin embargo, la aparición de una variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (vECJ) en el Reino Unido en la década de 1990 - posiblemente debido al consumo de productos cárnicos infectados con EEB (Bruce, et al, 1997; Hill et al, 1997) - ha planteado la posibilidad de niveles mucho más altos de incidencia de la ECJ.

La naturaleza de las enfermedades transmisibles EET se debe a una única entidad infecciosa, llamada prión, que se propone que no tiene componentes de ácidos nucleicos (Prusiner 1982). Las enfermedades EET se caracterizan por la formación de formas mutantes (PrP^Sc) de la proteína priónica celular normal (PrP^c). El prión mutante, PrP^Sc, es muy resistente a la degradación física y química. En particular, el PrP^Sc es muy resistente a la proteasa, en comparación con el prión normal, el PrP^c.

Los priones resistentes a la proteasa pueden producirse de manera hereditaria como resultado de mutaciones (es decir, enfermedad EET familiar), o de forma esporádica mediante un mecanismo aún no definido (es decir, enfermedad EET esporádica). Además, los priones resistentes a la proteasa pueden producirse por "infección" después de la exposición del prión normal del al prión exógenos resistente - por ejemplo, mediante transfusión de sangre infectada, mediante la implantación de tejido o trasplante, o mediante la exposición a la contaminación de productos médicos e instrumentos quirúrgicos (es decir, enfermedad EET iatrogénica).

Se han adoptado prácticas rigurosas en las industrias agrícolas y las que transforman carne para reducir el riesgo de contaminación cruzada entre animales infectados con EEB y de la carne que se destina al consumo humano. Sin embargo, los animales infectados con EEB todavía pueden ser procesados de manera no intencionada en mataderos, sobre todo si el animal está en las etapas tempranas de la enfermedad y, por lo tanto, sin ser detectado como un huésped infectados con EET. También hay un riesgo considerable en la eliminación de material infectado con EEB conocido, especialmente si el equipo utilizado en la operación de eliminación se vuelve a utilizar posteriormente en las prácticas de la manipulación normal sin una esterilización adecuada.

La naturaleza resistente proteolítica del prión PrP^SC significa que no se ve afectada gran parte por los procedimientos estándar de esterilización. Así, la combinación de estabilidad excepcional, diversas vías de transmisión y problemas con el diagnóstico y la detección tiene importantes consecuencias para la salud pública.

En particular, ha resultado difícil definir el nivel de riesgo de transmisión de enfermedades priónicas humanas a través de la cirugía, trasplante o transfusión. Hay casos bien documentados de transmisión a través de neurocirugía (Bernoulli et al 1977; Brown et al, 2000), trasplante de duramadre (Anon, 1987; Brooke et al, 2004), y utilización de hormona de crecimiento humano (Brown, et al, 2000; Swerdlow et al, 2003), todos relativos a formas esporádicas de la enfermedad. La posibilidad de transmisión a través de cirugía de rutina también existe, y algunos estudios han sugerido que una mayor tasa de ECJ esporádica se incrementa con el número de actos quirúrgicos que una persona pueda haber sufrido (Collins et al, 1999, Ward et al, 2002).

El largo período de incubación de la enfermedad, ya sea a nivel pre-clínico o sub-clínico (revisado por Hill y Collinge, 2003) significa que actualmente no es posible estimar el número de personas portadoras de la enfermedad. Todos estos portadores, independientemente de si se van a desarrollar los síntomas, puede ser capaces de transmitir la enfermedad a otras personas, especialmente las personas de un determinado genotipo más susceptibles, a través de cualquiera de las rutas descritas anteriormente.

La aparición de la vECJ ha hecho la estimación de los niveles de riesgo mucho más difícil, ya que determinados aspectos de su presentación difieren sensiblemente del de las formas más tradicionales. A modo de ejemplo, el agente de la vCJD se encuentra en niveles mucho más altos en tejido linfoide como las amígdalas y el apéndice (Hilton et al, 2002; Joiner et al, 2002) y el sistema nervioso periférico (Herzog et al). Ambas características sugieren que la transmisión iatrogénica de la vECJ es más probable que en las formas tradicionales de ECJ, debido al número mucho mayor de prácticas quirúrgicas relacionadas con estos tejidos, en comparación con la cirugía del sistema nervioso central (aunque el material de prión se ha encontrado en el músculo esquelético de pacientes con ECJ esporádica - Glatzel et al, 2003). En la actualidad existen buenas evidencias de que la vECJ, al menos, puede transmitirse mediante transfusión sanguínea (Llewelyn et al, 2004; Peden et al, 2004), lo que aumenta aún más el riesgo asociado con la cirugía de rutina y el manejo de instrumentos quirúrgicos contaminados.

Las áreas clave de incertidumbre, en parte, resultan de la falta de una detección adecuada y/o herramientas de diagnóstico para la investigación de las EET, dando lugar a problemas importantes para la gestión, tanto de las EET humanas como las animales.

Se han desarrollado varios procedimientos para el análisis post-mortem de material cerebral de bovinos sospechosos de estar infectados con la EEB, y éstas han sido adaptadas para el diagnóstico de la caquexia crónica en los ciervos. Sin embargo, actualmente no hay procedimientos para pruebas ante-mortem en animales.

La detección y el diagnóstico de todas las formas de la enfermedad EET humana son muy difíciles, porque no hay ningún procedimiento de detección validado actualmente disponible. El diagnóstico de personas sospechosas de estar infectadas con una enfermedad EET, por lo tanto, es muy difícil, con las mediciones neurofisiológicas y los resultados de comportamiento como principal criterio de diagnóstico, con el apoyo de biopsia de las amígdalas, y confirmación solamente post mortem. En este sentido, la biopsia de las amígdalas - aunque proporciona datos útiles de soporte para el diagnóstico - actualmente no es definitiva y no es propicia para su uso diagnóstico con fines de detección. En particular, la utilidad de la biopsia de la amígdala se limita a la detección de la vECJ (ya que el agente de priones vCJD no se encuentra en niveles significativos en el tejido de las amígdalas en la forma familiar, esporádica o iatrogénica de la ECJ).

La identificación del tipo de cepas EET sigue siendo un área importante de investigación, ya que la identificación de los orígenes de una de cepas EET puede ayudar a identificar el origen del agente, y puede aportar pruebas valiosas respecto a la ruta de la infección. Los procedimientos conocidos para identificar los orígenes de las cepas de EET incluyen diferentes procedimientos bioquímicos (que todavía no están totalmente demostrados) y bioensayos con cepas de origen animal múltiples para definir la relación de infectividad de la cepa aislada. Estos estudios consumen mucho tiempo, son costosos, y el trabajo con números de animales potencialmente grandes tiene implicaciones éticas.

Así, la disponibilidad de un procedimiento adecuado para la detección y el cultivo de las cepas de EET sería sumamente valioso, tanto en términos de ser capaz de reducir la dependencia de los ensayos con animales, sino también en términos de reducir el coste y el tiempo necesarios para el diagnóstico.

Aparte de su potencial de...

1. Procedimiento para infectar una línea celular diana con un agente EET, que comprende:

i)        formar una preparación de membrana que contiene un agente EET de un primer tipo de célula animal en una primera membrana; y mezclar dicha preparación de membrana con una segunda membrana de un segundo tipo de célula animal; en el que el primer y segundo tipos de células animales son diferentes;

ii)        formar una membrana contigua que comprende dicho agente EET y dicha segunda membrana;

iii)        poner en contacto dicha línea celular diana con dicha membrana contigua;

y así infectar dicha línea celular diana con dicho agente EET;

en el que la segunda membrana es del mismo tipo de células animal que la de la línea celular diana.

2. Procedimiento para infectar una línea celular diana con un agente EET, que comprende:

i)        formar una preparación de membrana que contiene un agente EET de una primera especie animal, en una primera membrana, y mezclar dicha preparación de membrana con una segunda membrana de una segunda especie animal, en donde la primera y segunda especies animales son diferentes;

ii)        formar una membrana contigua que comprende dicho agente EET y dicha segunda membrana;

iii)        poner en contacto dicha línea celular diana con dicha membrana contigua;

y así infectar dicha línea celular diana con dicho agente EET;

en el que la segunda membrana es de la misma especie animal que la línea celular diana.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el agente EET de dicho primer tipo de célula animal y la segunda membrana son de diferentes especies animales.

4. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el agente EET de la primera especie animal y la segunda membrana son de diferentes tipos de células animales.

5. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que el TSE se selecciona entre el grupo formado por ECJ, vECJ, ECJ esporádica, ECJ familiar, ECJ yatrogénica, EEB, EEB ovina, y CWD.

6. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la fuente del agente EET se selecciona entre el grupo formado por tejidos linfáticos (por ejemplo, amígdalas, apéndice, amígdala rectal), tejidos neuronales (por ejemplo, cerebro, sistema nervioso central), y sangre (por ejemplo, linfocitos).

7. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la línea celular diana se selecciona entre el grupo formado por células neuronales (por ejemplo, células de neuroblastoma), y células de fibroblasto.

8. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la segunda membrana y la línea celular diana son de una especie animal seleccionado entre el grupo que consisten de humanos, ovejas, vacas, ratones y ciervos.

9. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la segunda membrana y la línea celular diana son de un tipo de célula seleccionado entre el grupo formado por células de neuroblastoma (por ejemplo, NB69, SK-N-SH, y Kelly).

10. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la línea celular diana y la célula de la cual se obtiene el agente EET son de la misma especie animal, preferentemente del grupo que consiste en humanos, ovejas, vaca, ratón, y ciervos.

11. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la línea celular diana y la célula de la que se obtiene el agente EET son del mismo tipo celular, preferiblemente del grupo que consiste en células de neuroblastoma (por ejemplo, NB69, SK-N-SH, y Kelly).

12. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la segunda membrana y la célula de la que se obtiene el agente EET son del mismo tipo celular, preferentemente del grupo que consiste en células de neuroblastoma (por ejemplo, NB69, SK-N-SH, y Kelly).

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el agente EET se selecciona entre el grupo que consiste en ECJ, vECJ, ECJ esporádica, ECJ familiar, ECJ yatrogénica, y en el que la línea celular diana y la segunda membrana son de una especie no humana (por ejemplo, de ratón, rata, vaca, oveja, ciervo).

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el agente EET es EEB, y en el que la línea celular diana y segunda membrana son de especies no bovinas (por ejemplo, de humano, ratón, rata, oveja o ciervo).

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el agente EET es CWD, y en el que la línea celular diana y la segunda membrana son de especies no de ciervo (por ejemplo, de humano, ratón, rata, vaca u oveja).

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el agente EET es EEB o la tembladera ovina, y en el que la línea celular diana y la segunda membrana son de una especie no ovina (por ejemplo, de humano, ratón, rata, vaca o ciervo).

17. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la primera o segunda membrana es una membrana microsomal.