Quinasa termoestable unida covalentemente para la validación de un proceso de descontaminación.

Método de validación de un proceso de tratamiento para reducir la cantidad o actividad de un contaminante enuna muestra,

que comprende las etapas de:

(a) obtener una muestra que contiene o es sospechosa de contener un contaminante;

(b) someter la muestra a un proceso de tratamiento en presencia de una cantidad definida de un indicador deproceso biológico que comprende una quinasa termoestable unida covalentemente a un componente biológico;

(c) medir la actividad residual de quinasa y opcionalmente calcular la reducción en la actividad de quinasa; y

(d) comparar dicha actividad residual de quinasa con una actividad de quinasa predeterminada, o comparar dichareducción en la actividad de quinasa con una reducción predeterminada en la actividad de quinasa, donde laactividad predeterminada de quinasa o la reducción predeterminada en la actividad de quinasa corresponde a unareducción confirmada en la cantidad o actividad del contaminante bajo las mismas condiciones.

Quinasa termoestable unida covalentemente para la validación de un proceso de descontaminación.

La presente invención se refiere al campo de indicadores biológicos, y en particular a indicadores biológicos para la validación de procesos de tratamiento diseñados para reducir la cantidad o actividad de un contaminante en una muestra. La presente invención se refiere además a métodos de preparación de estos indicadores y a los usos de los mismos.

Se conocen una amplia variedad de indicadores biológicos para validar procesos de limpieza y descontaminación. Éstos varían desde indicadores relativamente básicos, tales como los que utilizan una “valoración visual” simple para valorar si un proceso ha sido eficaz, hasta indicadores más sofisticados que dependen de quinasas termoestables como enzimas informadoras (WO2005/093085) . Estos indicadores basados en quinasas han sido un desarrollo importante en el campo de indicadores biológicos, proporcionando un medio rápido y sensible de validación de procesos.

El documento WO2005/093085 describe en detalle la producción y la utilización de los indicadores basados en quinasas referidos anteriormente. En resumen, se prepara un indicador habitual mediante la adsorción de una quinasa termoestable sobre un soporte sólido, tal como una tira indicadora o tira reactiva. A continuación, el indicador se incluye con una muestra (que contiene un contaminante) a tratar, y el indicador más la muestra se someten a un proceso de tratamiento. A continuación, la reducción en la actividad de la quinasa indicadora por el tratamiento se correlaciona con la reducción en la cantidad o la actividad del contaminante. Cuando se determina un nivel de actividad que es conocido por correlacionarse con una reducción aceptable en el contaminante, a continuación el tratamiento se considera como validado.

Se ha encontrado que el rendimiento de estos indicadores basados en quinasas se puede mejorar significativamente mediante la reticulación covalente de la quinasa termoestable con un componente biológico, donde el componente biológico es un mimético/sustituto del contaminante. Esto permite que el indicador refleje de manera más precisa la reacción del contaminante al proceso de tratamiento, que, a su vez, conduce a precisión/sensibilidad mejorada del indicador y, de este modo, menos “falsas” validaciones de procesos.

De manera ventajosa, el componente biológico puede ser parte de una matriz o mezcla biológica, tal como muestra contaminada de análisis disponible comercialmente (suelo de Browne, suelo de Edimburgo, etc.) , sangre, tejido neurológico, alimentos, material de animal sacrificado, suero, óvulos, moco, o una muestra contaminada de análisis producida para cumplir con los requisitos específicos del usuario. De este modo, la reducción en la cantidad/actividad de la quinasa es función de las diversas propiedades de la matriz, lo cual mejora adicionalmente la precisión/sensibilidad del indicador.

Un indicador de este tipo también es capaz de monitorizar la eliminación/desactivación de un componente específico de la matriz o mezcla. De manera ventajosa, se puede diseñar un indicador de manera que la quinasa termoestable esté unida al componente de la matriz más “difícil” de eliminar/desactivar (por ejemplo, en una matriz de sangre, la fibrina es mucho más difícil de eliminar que la hemoglobina) . Esto proporciona una validación extremadamente rigurosa del proceso de tratamiento.

Los indicadores descritos anteriormente también presentan la ventaja de proporcionar validaciones de procesos rápidas de una etapa. Esto contrasta con ciertos indicadores de validación conocidos que requieren múltiples etapas para la validación y, por tanto, requieren una mayor inversión de tiempo y esfuerzo. A modo de ejemplo, el documento WO00/65344 describe la utilización de un prión de levadura como indicador biológico para un proceso de descontaminación de priones. Al final del proceso, en una etapa adicional, el operador debe analizar la destrucción del prión de levadura a efectos de validar el proceso, En cambio, los indicadores descritos anteriormente se diseñan para tener una quinasa indicadora unida directamente a un componente biológico que mimetiza el contaminante relevante (por ejemplo, prión) , de manea que la destrucción de este componente está íntimamente unido a la pérdida de actividad quinasa. Por tanto, estos indicadores son capaces de proporcionar una indicación rápida en una única etapa de la eficacia de proceso.

Por lo tanto, la presente invención se refiere al problema de proporcionar un indicador biológico de base quinasa alternativo/mejorado.

Indicador de procesos biológicos [0009] En un primer aspecto de la invención, se proporciona un indicador de proceso biológico para validar un proceso de tratamiento en el que se reduce la cantidad o actividad de un contaminante en una muestra, en el que el indicador comprende una quinasa termoestable unida covalentemente a un componente biológico, con la condición de que el componente biológico no sea un anticuerpo.

En una realización, el componente biológico es un mimético o sustituto del contaminante y, por tanto, reacciona al proceso de tratamiento sustancialmente de la misma manera que el contaminante. En otra realización, el componente biológico puede ser el mismo, pero físicamente diferente, que el contaminante en la muestra que se va someter al proceso de tratamiento, por ejemplo, si el contaminante es una proteína, entonces el componente biológico es también una proteína; si el contaminante es una proteína de la sangre, el componente biológico es también una proteína de la sangre; si el contaminante es una molécula de ADN, entonces el componente biológico es también una molécula de ADN; si el contaminante es una molécula de ARN, entonces el componente biológico es también una molécula de ARN, etc, para cada uno de los contaminantes y componentes biológicos descritos en esta memoria. En una realización adicional, el componente biológico puede ser diferente del contaminante.

Entre los componentes biológicos que se pueden utilizar en los indicadores de la invención se incluyen proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos y lípidos.

En una realización, el componente biológico comprende una proteína seleccionada del grupo que consiste en una proteína de la sangre, una proteína bacteriana, una proteína viral, una proteína fúngica, y una proteína autoagregante y una proteína formadora de amiloides.

En una realización adicional, la proteína de la sangre se selecciona del grupo que consiste en proteínas de la coagulación de la sangre (por ejemplo, fibrinógeno, péptidos de fibrina, fibrina, sustratos de transglutaminasa, trombina) , proteínas de suero (por ejemplo, albúmina y globulina) , proteínas de plaquetas, glicoproteínas de células sanguíneas y hemoglobina.

En otra realización, la proteína bacteriana se selecciona del grupo que consiste en una proteína fimbrial bacteriana (por ejemplo, CgsA de E.coli y AgfA de Salmonella) , una proteína de toxina bacteriana (por ejemplo, toxinas de Bacillus anthracis, Cor y nebacterium diphtheriae, Clostridium botulium) , una proteína de la superficie celular bacteriana (por ejemplo, peptidoglicano, lipoproteínas) , y una proteína de espora bacteriana (por ejemplo, de bacterias Gram positivas y que tienen una secuencia similar o estructura global con las proteínas que forman los apéndices de los lazos en Clostridum taeniosporum, proteínas chaplina, proteínas rodlina) .

En otra realización, la proteína viral se selecciona del grupo que consiste en una proteína de la cubierta viral, una proteína de la cápside viral y una proteína del núcleo viral. De manera adecuada, las proteínas virales son de un virus bacteriófago (por ejemplo, las proteínas MS2 y PP7) , virus norwalk (por ejemplo, proteína de la cápside) , rotavirus (por ejemplo, proteínas VP2, VP6 y VP7) , coronavirus (por ejemplo, proteínas SARS S, E y M) , virus de la lengua azul (por ejemplo, proteína VP2) , virus del papiloma humano (por ejemplo, proteína estructural principal viral, L1) , hepatitis B (por ejemplo, proteína de la cubierta pequeña HBsAg) , virus de la Hepatitis C (por ejemplo, proteínas del núcleo E1 y E2) , virus de la gripe (por ejemplo, proteínas de neuraminidasa y hemaglutinina y de matriz) , virus de la polio (por ejemplo, proteínas de la cápside VP0, 1 y 3) , VIH (por ejemplo, proteína de la cubierta Pr55gag) y virus del dengue B (por ejemplo, cubierta (e) y pre-membrana/ membrana (prM/M) .

En otra realización, la proteína fúngica se selecciona del grupo que consiste en proteínas de hidrofobinas... [Seguir leyendo]

1. Método de validación de un proceso de tratamiento para reducir la cantidad o actividad de un contaminante en una muestra, que comprende las etapas de:

(a) obtener una muestra que contiene o es sospechosa de contener un contaminante;

(b) someter la muestra a un proceso de tratamiento en presencia de una cantidad definida de un indicador de proceso biológico que comprende una quinasa termoestable unida covalentemente a un componente biológico;

(c) medir la actividad residual de quinasa y opcionalmente calcular la reducción en la actividad de quinasa; y

(d) comparar dicha actividad residual de quinasa con una actividad de quinasa predeterminada, o comparar dicha reducción en la actividad de quinasa con una reducción predeterminada en la actividad de quinasa, donde la actividad predeterminada de quinasa o la reducción predeterminada en la actividad de quinasa corresponde a una reducción confirmada en la cantidad o actividad del contaminante bajo las mismas condiciones.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la reducción predeterminada en la actividad de quinasa es por lo menos una reducción de 3 veces logarítmicas, o por lo menos una reducción de 6 veces logarítmicas, o por lo menos una reducción de 7 veces logarítmicas, o por lo menos una reducción de 8 veces logarítmicas.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la reducción confirmada en la cantidad o actividad del contaminante es por lo menos una reducción de 3 veces logarítmicas, o por lo menos una reducción de 6 veces logarítmicas, o por lo menos una reducción de 7 veces logarítmicas, o por lo menos una reducción de 8 veces logarítmicas.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende medir la actividad de quinasa antes de tratar la muestra y después de tratar la muestra.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende tratar la muestra a 80°C durante por lo menos 10 minutos antes de medir la actividad residual de la quinasa.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la medición de la actividad residual de la quinasa comprende añadir un sustrato que comprende ADP a la quinasa residual y medir la formación de ATP.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende continuar el tratamiento hasta que la actividad residual de quinasa o la reducción en la actividad de quinasa corresponda a una reducción confirmada en la cantidad o actividad del contaminante de por lo menos 3 veces logarítmicas, o por lo menos 6 veces logarítmicas,

o por lo menos 7 veces logarítmicas, o por lo menos 8 veces logarítmicas.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además la etapa de registrar los datos obtenidos en la etapa (c) en un portador de datos adecuado.

9. Utilización de una quinasa termoestable unida covalentemente a un componente biológico como un indicador de procesos biológicos para validar un proceso de tratamiento para reducir la cantidad o actividad de un contaminante en una muestra.

10. Indicador de proceso biológico para validar un proceso de tratamiento en el que se reduce la cantidad o actividad de un contaminante en una muestra, en el que el indicador comprende una quinasa termoestable unida covalentemente a un componente biológico, y en el que el componente biológico no es un anticuerpo, y en el que el componente biológico se selecciona del grupo que consiste en: una proteína de la sangre; una proteína fúngica seleccionada del grupo que consiste en proteínas de hidrofobinas, proteínas de esporas fúngicas, proteínas hifales, micotoxinas y priones fúngicos; una proteína de autoagregación seleccionada del grupo que consiste en priones, proteínas miméticas de priones, fibrilas amiloides, proteína beta amiloide, proteína tau, proteína de unión a poliadenina, proteína C de surfactante de pulmón, hidrofobinas, chaplinas, rodlinas, proteínas de cubiertas de esporas gram positivas, y proteínas de tipo cemento de percebe; una proteína fimbrial bacteriana; una proteína de toxina bacteriana; una proteína de espora bacteriana; un ácido nucleico; un lípido; y un carbohidrato.

11. Indicador de proceso biológico según la reivindicación 10, en el que dicha proteína de sangre se selecciona del grupo que consiste en proteínas de coagulación de la sangre, proteínas del suero, proteínas de plaquetas, glicoproteínas de células sanguíneas y hemoglobina, preferiblemente en el que dicha proteína de coagulación de la sangre se selecciona del grupo que consiste en fibrina, fibrinógeno y sustratos de transglutaminasa.

12. Indicador de proceso biológico según la reivindicación 10, en el que el ácido nucleico se selecciona entre una molécula de ADN o una molécula de ARN.

13. Indicador de proceso biológico según la reivindicación 10, en el que el carbohidrato se selecciona del grupo que consiste en exopolisacárido, lipopolisacárido, peptidoglicano, quitina, glucano, lignina, mucina, glicolípidos, glicoproteínas, extractos de esporas, polisacáridos de cápsulas de levadura, y secreciones de invertebrados.

14. Indicador de proceso biológico según la reivindicación 10, en el que el lípido se selecciona del grupo que consiste en glicolípidos y gangliósidos.

15. Indicador de proceso biológico según las reivindicaciones 10-13, en el que el indicador es parte de una matriz biológica, preferiblemente en el que la matriz biológica es un mimético de la muestra.

16. Indicador de proceso biológico según la reivindicación 15, en el que la matriz biológica comprende uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en sangre, suero, albúmina, moco, óvulo, tejido neurológico, alimento, material de animal sacrificado y una muestra de contaminante de análisis disponible comercialmente.

17. Indicador de proceso biológico según las reivindicaciones 10-16, en el que la quinasa termoestable es adenilato quinasa, acetato quinasa o piruvato quinasa.

18. Indicador de proceso biológico según las reivindicaciones 10-17, en el que el indicador comprende además un agente para estabilizar la quinasa, preferiblemente el agente estabilizante se selecciona del grupo que consiste en iones metálicos, azúcares, alcoholes de azúcares y agentes formadores de geles.

19. Indicador de proceso biológico según las reivindicaciones 10-18, en el que el componente biológico y la quinasa están unidas juntas en forma de una proteína de fusión.

20. Indicador de proceso biológico según las reivindicaciones 10-19, en el que el indicador de proceso biológico está inmovilizado en o sobre un soporte sólido, preferiblemente en el que el indicador de proceso biológico está inmovilizado en o sobre el soporte sólido mediante reticulación o adsorción química.

21. Indicador de proceso biológico según la reivindicación 20, en el que el soporte sólido es una tira indicadora, una tira reactiva o una microesfera.

22. Kit para utilizar en la validación de un proceso de tratamiento en el que se reduce la cantidad o actividad de un contaminante en una muestra, que comprende:

(a) un indicador de proceso biológico según cualquiera de las reivindicaciones 10-21, y

(b) un sustrato para la quinasa termoestable, preferiblemente en el que el sustrato para la quinasa termoestable es ADP.

23. Kit según la reivindicación 18, que comprende además luciferina/luciferasa; y/o que comprende además una tabla de búsqueda que correlaciona la actividad de quinasa del indicador con la cantidad o actividad del contaminante.

24. Método según la reivindicación 1, en el que el indicador de proceso biológico en la etapa (B) es un indicador de proceso biológico según cualquiera de las reivindicaciones 10-21, o la utilización de un indicador biológico según cualquiera de las reivindicaciones 10-21, para validar un proceso de tratamiento para reducir la cantidad o actividad de un contaminante en una muestra.

Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9