Poliovirus atenuados.

Un poliovirus atenuado que no tiene un par de bases mal emparejado en el tallo (a) del dominio V de la región nocodificante 5' de su genoma y no tiene un par de bases mal emparejado en el tallo (b) del dominio V de la región nocodificante 5' de su genoma,

en el que al menos siete de los pares de bases en los tallos (a) y (b) son pares debases U-A o A-U.

Poliovirus atenuados

Campo de la invención La presente invención se refiere a poliovirus atenuados, a su preparación y a las vacunas que los contienen. Más específicamente, la invención se refiere a poliovirus que se atenúan y estabilizan genéticamente por la introducción de mutaciones definidas en sus genomas. Estos poliovirus son particularmente útiles como bases para vacunas de polio inactivadas.

Antecedentes de la invención Las vacunas de polio atenuadas desarrolladas por Sabin en la década de 1950, se han utilizado por todo el mundo. Las cepas vacunales derivadas de cada uno de los tres serotipos de poliovirus, denominados tipos Sabin 1, 2 y 3, se preparaban por pases de los virus del tipo silvestre en cultivos celulares y animales vivos, hasta que se obtenían cepas atenuadas. Estos virus atenuados son sustancialmente menos capaces de causar poliomielitis en seres humanos que las cepas originales del tipo silvestre. Se administran por vía oral y se replican en el intestino para inducir una respuesta inmunitaria protectora.

Aunque las vacunas orales de poliovirus vivo se consideraban en general seguras, su uso se asoció con una pequeña incidencia de parálisis en los vacunados. Esta se asociaba sobre todo con los serotipos 2 y 3 y raramente, si acaso, con el tipo 1. Por eso, se han hecho esfuerzos para desarrollar vacunas tipo 2 y tipo 3 mejoradas, que fueran al menos comparables en seguridad con la excelente cepa tipo 1.

Las cepas vacunales Sabin se desarrollaron esencialmente por métodos empíricos. La base genética de su atenuación no se comprende por completo. Durante los últimos años, sin embargo, los científicos han empleado varias técnicas biológicas moleculares en un intento de aclarar el mecanismo por el cual se reduce la neurovirulencia de estas cepas vacunales. La mayoría de los trabajos se han concentrado en los serotipos 1 y 3. Para ambos, se han comparado las secuencias completas de nucleótidos de las cepas vacunales con las de sus progenitores neurovirulentos.

En el caso del poliovirus tipo 1, las cepas vacunales difieren de su progenitor en 47 posiciones de las 7441 del genoma base (Nomolo et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 79:5793-5797, 1982) . Todas ellas son mutaciones puntuales simples y 21 de ellas provocan cambios de aminoácidos en las proteínas codificadas por el virus. Aunque se cree que varias mutaciones contribuyen al fenotipo de atenuación de la cepa vacunal, se ha presentado una prueba directa de que la mutación de A-G en la posición 480 de la región no codificante 5’ del genoma tiene un marcado efecto atenuante sobre el virus (Nomolo et al., UCLA Symp. Mol. Cell. Biol., New Series, 54 (Eds M.A Brinton R.R. Rueckert) : 437-452, New York: Alan R. Liss Inc., 1987) ) .

Estudios análogos en poliovirus tipo 3 revelan solo 10 diferencias en la secuencia de nucleótidos en las 7432 bases del genoma entre la cepa vacunal y la de su progenitor (Stanway et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 81:1539-1543, 1984) . Solo tres de estas provocan sustituciones de aminoácidos en las proteínas codificadas por los virus. Las posiciones de las bases en la región no codificante 5’ del genoma del poliovirus tipo 3 se numeran en el presente documento de acuerdo con el sistema de numeración de Stanway et al., 1984.

La construcción de recombinantes definidos entre la cepa vacunal Sabin tipo 3 y su cepa progenitora ha permitido la identificación de mutaciones que contribuyen al fenotipo de atenuación. Una de estas es en la posición 2034 y causa un cambio de serina a fenilalanina en la proteína VP3 vírica.

La otra mutación de interés es C (progenitor) a U (cepa vacunal) en la posición 472 de la región no codificante 5’ del genoma. Se ha observado que esta mutación U 472 se invierte a C 472 del progenitor (tipo silvestre) rápidamente una vez que el virus se replica en el intestino del ser humano (Evans et al., Nature 314:548-550, 1985) . Esta inversión se asocia con un incremento de la neurovirulencia. La C en la posición 472 se ha mostrado esencial para el crecimiento de un virus recombinante ratón/humano en el cerebro de ratón (La Monica et al., J. Virol. 57:515-525, 1986) . Más recientemente, se ha observado que la A cambia a G en la posición 481 del poliovirus tipo 2, de nuevo en la replicación del virus en el intestino de los vacunados (Macadam et al., Virología 181: 379-392, 1991) .

Se propuso anteriormente un modelo de la estructura secundaria de la región no codificante 5’ del genoma de la cepa Leon del poliovirus tipo 3 (Skinner et al., J. Mol. Biol. 207: 379-392, 1989) . En lo que concierne al dominio V (nucleótidos 471-538) , las bases en las posiciones 471-473 y 477-483 están emparejadas con las bases en las posiciones 538-536 y 534-528 respectivamente como sigue:

471 477 483

… UCC … CCAUGGA …

… AGG … GGUGCCU …

538 534 528

Por conveniencia, las regiones emparejadas se denominan tallo (a) (471-473/534-536) y tallo (b) (477-483/534-528) . Previamente, se descubrió que un poliovirus tipo 3 con el par de bases 472-537 invertido, por ejemplo 472 G y 537 C, estaba atenuado. Además, este virus atenuado tenía un valor de DL50 ligeramente más bajo que el poliovirus correspondiente que solo tenía la mutación C a G en la posición 472 pero que retenía la G del tipo silvestre en la posición 537. Los poliovirus atenuados en los que los pares de bases del tallo (a) o el tallo (b) del dominio V están invertidos se desvelan en el documento EP-A-0383433. Sin embargo, experimentos posteriores demostraron que el poliovirus tipo 3 en el que el par de bases en 472-537 está invertido no está tan atenuado como el tipo 3 de la cepa vacunal Sabin.

Se ha informado anteriormente de la producción de poliovirus atenuados que tienen sustancialmente la misma atenuación o mayor atenuación que la cepa vacunal Sabin (por lo que son seguros para usarlos) pero que son mucho más estables genéticamente. Estos poliovirus atenuados no tienen un par de bases U-G u otro par de bases mal emparejado en el tallo (a) o (b) del dominio V de la región no codificante 5’ del genoma del poliovirus. (Se considera un emparejamiento malo la desviación del emparejamiento de bases de Watson-Crick) . Más específicamente, se prepararon poliovirus de tipo 3 que contenían los siguientes pares de bases U-A:

(a) S15: U-A en 472-537, U-A en 480-531 y U-A en 481-530; o

(b) S16: U-A en 472-537, U-A en 480-531 y A-U en 482-529.

En condiciones en las que se seleccionaban rápidamente variantes neurovirulentas de Sabin 3, los fenotipos de atenuación de esas cepas de poliovirus fueron estables (Documento WO98/41619) .

Como resultado del éxito del programa global de erradicación de la polio, la proporción de casos atribuible a las cepas derivadas de vacunas se ha incrementado dramáticamente y continuará haciéndolo hasta que cese la vacunación con virus vivos. En parte como respuesta a esto, muchos países desarrollados ya han cambiado a las vacunas de polio inactivadas (VPI) que se producen actualmente a partir de cepas silvestres. Cuando la polio silvestre se erradique, las cepas silvestres requerirán altos niveles de contención biológica, que puede que no sean fáciles de conciliar con la escala de producción requerida para VPI, haciendo atractivo el uso de cepas vacunales atenuadas para la fabricación de VPI, aunque se ha argumentado que ambas, la cepa silvestre y la cepa atenuada básicamente presentan los mismos problemas de contención.

Sigue existiendo la necesidad de cepas de poliovirus que no sean infecciosos para humanos a los niveles de exposición que se encuentran potencialmente en las instalaciones de producción de vacunas. Esto reduciría significativamente la posibilidad de escape en el entorno y las consecuencias del escape serían insignificantes incluso después de que la vacunación con virus vivo haya cesado. Tales cepas se pueden cultivar a niveles de contención que no sean prohibitivos para los fabricantes de vacunas.

Sumario de la invención Últimamente, se han diseñado y construido cepas de poliovirus que pueden resolver la seguridad y los problemas de contención de los virus de base de VPI actuales. Estas cepas crecían con títulos tan altos como los de las cepas Sabin en cultivos celulares a 33 ºC, pero la infectividad a 37 ºC se reducía significativamente, incluso más de un millón de veces en un caso. Esta cepa tipo 3 se mostró completamente atenuada, sin causar síntomas clínicos en ninguno, cuando se inoculaba intraespinalmente en ratones TgPVR a una dosis 5.000 veces más alta que la dosis de Sabin 3 requerida para paralizar el 50% de los ratones. Las cepas también se... [Seguir leyendo]

1. Un poliovirus atenuado que no tiene un par de bases mal emparejado en el tallo (a) del dominio V de la región no codificante 5’ de su genoma y no tiene un par de bases mal emparejado en el tallo (b) del dominio V de la región no codificante 5’ de su genoma, en el que al menos siete de los pares de bases en los tallos (a) y (b) son pares de bases U-A o A-U.

2. Un poliovirus de acuerdo con la reivindicación 1, en el que al menos cinco de los pares de bases en el tallo (b) son pares de bases U-A o A-U.

3. Un poliovirus de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que seis de los pares de bases en el tallo (b) son pares de bases U-A o A-U.

4. Un poliovirus de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que siete de los pares de bases en el tallo (b) son pares de bases U-A o A-U.

5. Un poliovirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dos de los pares de bases en el tallo (a) son pares de bases U-A o A-U.

6. Un poliovirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que tres de los pares de bases en el tallo (a) son pares de bases U-A o A-U.

7. Un poliovirus atenuado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende el dominio V de la región no codificante 5’ del poliovirus tipo 3 en el que un par de bases U-A está presente en la posició.

47. 537 en el tallo (a) y en las posicione.

47. 533.

48. 531 .

48. 530 en el tallo (b) .

8. Un poliovirus de acuerdo con la reivindicación 7, en el que un par de bases A-U está presente en la posición 482529 del tallo (b) .

9. Un poliovirus de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que un par de bases A-U está presente en la posició.

47. 534 del tallo (b) .

10. Un poliovirus atenuado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que está inactivado.

11. Un poliovirus de acuerdo con la reivindicación 10, para su uso en una vacuna.

12. Una vacuna que comprende un poliovirus como se define en la reivindicación 10 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

13. Uso de un poliovirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 como base de una vacuna de polio inactivada (VPI) .

14. Un método para preparar una vacuna de polio inactivada, que comprende:

(i) cultivar un poliovirus atenuado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9;

(ii) inactivar dichos poliovirus; y

(iii) formular dicho poliovirus inactivado con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.