Un procedimiento de ensayo, que comprende las etapas de: (a) obtener una muestra que se sospecha que contiene una forma patógena de proteína priónica (PrP Sc ) que tiene un núcleo resistente a proteasa y una región de octarrepetición,

en el que dicha muestra puede contener o puede no contener una forma normal de proteína priónica (PrP C ); (b) tratar dicha muestra con al menos una proteasa específica del sitio en condiciones en las que la digestión proteolítica de dicha PrP Sc y dicha PrP C , si está presente, da como resultado dicha PrP Sc y dicha PrP C , si está presente, que está escindida en al menos el 90% de todos los sitios de escisión de proteasa disponible, en el que dicha proteasa específica del sitio es tripsina o S-V8, i. en el que dicha PrP Sc no tiene sitio de escisión para dicha proteasa dentro de dicha región de octarrepetición o entre dicha región de octarrepetición y dicho núcleo resistente a proteasa, de manera que un fragmento de la región amino-proximal que incluye dicha región de octarrepetición sigue estando conectado a dicho núcleo resistente a proteasa tras dicha digestión proteolítica, y ii. en el que dicha PrP C tiene al menos un sitio de escisión disponible para dicha proteasa dentro de la región de aminoácidos que corresponde a dicho núcleo resistente a proteasa, y dicho al menos un sitio de escisión disponible se escinde mediante dicha digestión proteolítica; (c) prevenir cualquier digestión proteolítica adicional tras dicha digestión proteolítica en (b) añadiendo un inhibidor de la proteasa o eliminando dicha proteasa; (d) desnaturalizar dicha PrP Sc tratada con proteasa específica del sitio proporcionando de ese modo PrP Sc desnaturalizada; y (e) detectar la presencia de dicha PrP Sc desnaturalizada usando al menos dos componentes de unión, un primer componente de unión y un segundo componente de unión, i. en el que dicho primer componente de unión se une específicamente a un primer epítopo que está ubicado dentro de dicho fragmento de la región amino-proximal que sigue estando conectado a dicho núcleo resistente a proteasa tras dicha digestión proteolítica, y ii. en el que dicho segundo componente de unión se une específicamente a un segundo epítopo que está ubicado dentro de dicho núcleo resistente a proteasa, en el que dicho segundo epítopo está en una región de dicha PrP C que está separada de dicho primer epítopo tras dicha digestión proteolítica

Ensayo de priones Campo de la invención La invención se refiere a un procedimiento de ensayo para detectar la presencia de priones patógenos en una muestra. La invención se refiere también a kits que comprenden reactivos usados en el procedimiento de ensayo.

Antecedentes

Las enfermedades amiloideas se originan por la transición de proteína soluble en un forma agregada insoluble. También existen pruebas de que esta conversión está asociada con un cambio conformacional en la estructura secundaria y terciaria. Existen pruebas en aumento de que la acumulación de depósitos de proteínas dañan células y tejidos conduciendo a enfermedades. Varias enfermedades están asociadas con la deposición de proteínas específicas.

Un grupo de enfermedades conformacionales se denomina “enfermedades priónicas” o “encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) ”. Estas enfermedades se manifiestan en seres humanos y animales. En seres humanos, las enfermedades priónicas incluyen la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) , variante de ECJ (vECJ) , síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS) , insomnio familiar fatal y kuru (véase por ejemplo, Isselbacher et al., eds. (1994) . Harrison's Principles of Internal Medicine. New York: McGraw.Hill, Inc.; Medori et al. (1992) N. Engl. J. Med. 326: 444-9) . En animales, las enfermedades priónicas incluyen tembladera de las ovejas, encefalopatía espongiforme bovina (EEB) , encefalopatía transmisible del visón y enfermedad consuntiva crónica de alce y ciervo mulo en cautividad (Gajdusek, (1990) . Subacute Spongiform Encephalopathies: Transmissible Cerebral Amyloidoses Caused by Unconventional Viruses. En: Virology, Fields, ed., New York: Raven Press, Ltd. (pág. 22892324) ) .

Recientemente, la rápida propagación de EEB y su correlación con una elevada aparición de EET en seres humanos ha conducido a un aumento del interés en la detección de EET en mamíferos no humanos. Las consecuencias trágicas de la transmisión accidental de estas enfermedades (véase, por ejemplo, Gajdusek, Infectious Amyloids, and Prusiner Prions In Fields Virology. Fields, et al., eds. Philadelphia: Lippincott-Ravin, Pub. (1996) ; Brown et al. Lancet, 340: 24-27 (1992) ) , las dificultades de la descontaminación (Asher et al. (1986) En: Laborator y Safety: Principles and Practices, Miller ed., (pág. 59-71) Am. Soc. Micro.) y la preocupación sobre la EEB (British Med. J. (1995) 311: 1415-1421) son la base de la urgencia de tener tanto una prueba diagnóstica que identificaría seres humanos y animales con EET como terapias para sujetos infectados.

Los priones se diferencian significativamente de bacterias, virus y viroides. La hipótesis dominante es que, a diferencia de todos los otros patógenos infecciosos, la enfermedad se origina por una conformación anómala de la proteína priónica, que actúa como un molde y convierte conformaciones de priones normales en conformaciones anómalas, aberrantes. La proteína priónica, o PrP, se caracterizó por primera vez en los primeros años 1980. (véase, por ejemplo, Bolton et al. (1982) Science 218: 1309-1311; Prusiner et al. (1982) Biochemistr y 21: 6942-6950; McKinley et al. (1983) Cell 35: 57-62) . Los genes que codifican la proteína priónica completa desde entonces se han clonado, secuenciado y expresado en animales transgénicos. (véase, por ejemplo, Basler et al. (1986) Cell 46: 417428) . La forma celular normal de la proteína priónica, que se denomina también PrPC, es una proteína de 33-35 kD de función indefinida y, en seres humanos, está transcrita por un gen en el brazo corto del cromosoma 20. La proteína priónica conformada de manera anómala también se denomina una proteína escrapie o una proteína priónica patógena (PrPSc) . La deposición de PrPSc en el sistema nervioso central (SNC) está asociada con la degeneración de neuronas y es siempre letal. La PrPSc es infecciosa y la exposición a tejidos que contienen infectividad podría dar como resultado la enfermedad. La inoculación experimental de PrPSc en animales de laboratorio que incluyen primates, oveja, roedores y ratones transgénicos dieron como resultado la transmisión de la enfermedad priónica. (Véase, por ejemplo, Zhang et al. (1997) Biochem. 36 (12) : 3543-3553; Cohen & Prusiner (1998) Ann. Rev. Biochem. 67: 793-819; Pan et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10962-10966; Safar et al. (1993) J Biol. Chem. 268: 20276-20284.)

La estructura sustancialmente de lámina 1 de PrPSc en comparación con las formas no enfermas plegadas predominantemente de hélice a de PrPC se ha revelado mediante estudios de espectroscopía óptica y cristalografía. (Véase, por ejemplo, Wille et al. (2001) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99: 3563-3568; Peretz et al. (1997) J. Mol. Biol.

273: 614-622; Cohen & Prusiner, (1999) 5: Structural Studies of Prion Proteins. En Prion Biology And Diseases, S. Prusiner, ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold SpringHarbor Laborator y Press. (pág: 191-228) . Los cambios estructurales de PrPC a PrPSc parecen estar seguidos por alteraciones en las propiedades bioquímicas: PrPC es soluble en detergentes no desnaturalizantes, PrPSc es insoluble y forma oligómeros que están compuestos de hasta 1000 moléculas; PrPC se digiere fácilmente por proteasas, mientras que PrPSc es parcialmente resistente, dando como resultado la formación de un fragmento truncado de manera amino-terminal conocido como núcleo o forma “PrP 27-30” (27-30 kDa) , “PrPres” o “PK-resistant” (resistente a proteinasa K) , que corresponde al fragmento de residuos de aminoácidos de aproximadamente 90 a aproximadamente 231, enumerados según la secuencia de longitud completa de PrP de hámster sirio o humana incluyendo el péptido señal. (Véase, por ejemplo, Baldwin et al.

(1995) J. Biol. Chem. 270:19197-19200; Prusiner et al. (1982) Biochemistr y 21:6942-6950; Prusiner et al. (1983) Cell 35:349-358; Collinge, J. y Palmer, M.S. (1997) Prion Diseases, Oxford University Press, Nueva York) . Adicionalmente, PrPSc puede convertir PrPC en la conformación patógena. (Véase, por ejemplo, Kaneko et al. (1995) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 92:11160-11164; Caughey (2003) Br Med Bull. 66: 109- 20; Telling et al. (1995) Cell 83:79-90; Kaneko et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10069-10074; DebBurman et al. (1997) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 94: 13938-13943;.Horiuchi et al. (1999) EMBO J. 18:3193-3203; Horiuchi et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 5836-5841; Kocisko et al. (1994) Nature 370:471-474) .

Ha demostrado dificultad la detección de las isoformas patógenas de proteínas patológicas conformacionales en sujetos vivos, y las muestras obtenidas de sujetos vivos. Aunque la detección de amiloides en general puede conseguirse con tinción de rojo Congo, este tipo de tinción es impreciso y no sensible. La detección específica y de alta afinidad de una proteína dada en presencia de otras proteínas como en célula, tejido u homogeneizado se realiza normalmente con anticuerpos que son específicos para la proteína seleccionada como objetivo. No obstante, las proteínas que comparten la misma secuencia pero difieren en conformación complican la detección discriminatoria mediante anticuerpos. De hecho, la mayor parte de anticuerpos producidos frente a PrP se unen a PrPC o tanto a PrPC como a PrPSc (véase, por ejemplo, Matsunaga et al. (2001) Proteins: Structure, Function and Genetics 44: 110-118) . Además, la agregación de PrPSc reduce las concentraciones de epítopo eficaces para un anticuerpo; impidiendo de ese modo la unión eficaz de anticuerpos específicos a PrP. Por tanto, la inmunodetección eficaz de PrPSc necesita la disociación y desnaturalización de PrPSc en confórmeros similares a PrPC mientras se discrimina en contra de las moléculas de PrPC originales.

Varios procedimientos de inmunoensayo publicados se basaron en la comparación del nivel de unión de anticuerpos que sólo se unen a PrPC nativa pero no a PrPSc nativa con el nivel de unión de anticuerpos que se unen tanto a PrPSc como PrPC nativas con el fin de determinar la presencia de PrPSc. (Véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.214.565 B1 y 6.406.864 B2.) Otro procedimiento de inmunoensayo se basó también en comparar los niveles de unión a anticuerpo, pero implicaba una etapa de desnaturalización para desnaturalizar PrPSc y PrPC antes de la unión de éstos al mismo anticuerpo que el usado para unirse a PrPC nativa. (Véase la patente estadounidense n.º 5.891.641.) Sin embargo, existen limitaciones en estos procedimientos de ensayo porque, usando estos procedimientos, la detección mediante anticuerpos... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de ensayo, que comprende las etapas de:

(a) obtener una muestra que se sospecha que contiene una forma patógena de proteína priónica (PrPSc) que tiene un núcleo resistente a proteasa y una región de octarrepetición, en el que dicha muestra puede contener o puede no contener una forma normal de proteína priónica (PrPC) ;

(b) tratar dicha muestra con al menos una proteasa específica del sitio en condiciones en las que la digestión proteolítica de dicha PrPSc y dicha PrPC, si está presente, da como resultado dicha PrPSc y dicha PrPC, si está presente, que está escindida en al menos el 90% de todos los sitios de escisión de proteasa disponible, en el que dicha proteasa específica del sitio es tripsina o S-V8,

i. en el que dicha PrPSc no tiene sitio de escisión para dicha proteasa dentro de dicha región de octarrepetición o entre dicha región de octarrepetición y dicho núcleo resistente a proteasa, de manera que un fragmento de la región amino-proximal que incluye dicha región de octarrepetición sigue estando conectado a dicho núcleo resistente a proteasa tras dicha digestión proteolítica, y

ii. en el que dicha PrPC tiene al menos un sitio de escisión disponible para dicha proteasa dentro de la región de aminoácidos que corresponde a dicho núcleo resistente a proteasa, y dicho al menos un sitio de escisión disponible se escinde mediante dicha digestión proteolítica;

(c) prevenir cualquier digestión proteolítica adicional tras dicha digestión proteolítica en (b) añadiendo un inhibidor de la proteasa o eliminando dicha proteasa;

(d) desnaturalizar dicha PrPSc tratada con proteasa específica del sitio proporcionando de ese modo PrPSc desnaturalizada; y

(e) detectar la presencia de dicha PrPSc desnaturalizada usando al menos dos componentes de unión, un primer componente de unión y un segundo componente de unión,

i. en el que dicho primer componente de unión se une específicamente a un primer epítopo que está ubicado dentro de dicho fragmento de la región amino-proximal que sigue estando conectado a dicho núcleo resistente a proteasa tras dicha digestión proteolítica, y ii. en el que dicho segundo componente de unión se une específicamente a un segundo epítopo que está ubicado dentro de dicho núcleo resistente a proteasa, en el que dicho segundo epítopo está en una región de dicha PrPC que está separada de dicho primer epítopo tras dicha digestión proteolítica.

2. El procedimiento según la reivindicación 1,

(a) en el que dicha PrPSc comprende una secuencia seleccionada de SEC ID N.os 1 a 10; o

(b) en el que dicho primer epítopo está dentro de dicha región de octarrepetición; en el que opcionalmente dicho primer componente de unión es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en POM2, POM11, POM12, POM14, 3B5, 4F2, 13F10, SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35 y SAF-37; o

(c) en el que dicho primer epítopo está fuera de dicha región de octarrepetición; en el que opcionalmente dicho primer componente de unión es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en BAR210, BAR231 y 14D3.

3. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2,

(a) en el que dicha proteasa específica del sitio es tripsina; o

(b) en el que dicha proteasa específica del sitio es S-V8; en el que opcionalmente dicho segundo componente de unión es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en SAF-53, SAF54, SAF-60, SAF-61, SAF-66, SAF-69, SAF-70, SAF-75, SAF-76, Pri917, BAR234, Sha31, 11B9, 12F10, 6H4 y POM5; o

(c) en el que dichos componentes de unión son aptámeros; o

(d) en el que dichos componentes de unión son anticuerpos; en el que opcionalmente dichos anticuerpos son anticuerpos monoclonales; o

(e) en el que dicha etapa de detección se lleva a cabo usando un ELISA.

4. El procedimiento según la reivindicación 3 (e) ,

(a) en el que dicho primer componente de unión es un componente de unión de captura para capturar proteínas priónicas, y en el que dicho segundo componente de unión es un componente de unión de detección para detectar dicha PrPSc; o

(b) en el que dicho segundo componente de unión es un componente de unión de captura para capturar proteínas priónicas, y en el que dicho primer componente de unión es un componente de unión de detección para detectar dicha PrPSc.

5. El procedimiento según la reivindicación 4 (a) o 4 (b) , en el que dicho componente de unión de detección está marcado; en el que opcionalmente dicho componente de unión de detección está marcado con un conjugado de fosfatasa alcalina.

6. El procedimiento según la reivindicación 3 (a) ,

(a) en el que dicho segundo componente de unión es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en 3F4, POM1, POM4, POM5, POM6, POM7, POM8, POM9, POM10, POM13, POM15, POM16, POM17, POM19, SAF-2, SAF-4, SAF-8, SAF-9, SAF-10, SAF-12, SAF-13, SAF-14, SAF-22, SAF-24, SAF53, SAF-54, SAF-60, SAF-61, SAF-66, SAF-68, SAF-69, SAF-70, SAF-75, SAF-76, SAF-82, SAF-83, SAF84, SAF-95, Pri308, Pri917, BAR215, BAR221, BAR224, BAR233, BAR234, Sha31, 11B9, 12F10, D18, 6H4 y BDI115; o

(b) en el que dicha PrPC contiene un dominio globular dentro de secuencias de aminoácidos que corresponden a dicho núcleo resistente a proteasa, y en el que dicho segundo epítopo está ubicado dentro de dicho dominio globular.

7. El procedimiento según la reivindicación 6 (b) , en el que dicho segundo componente de unión es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en POM1, POM4, POM5, POM6, POM7, POM8, POM9, POM10, POM 13, POM15, POM 16, POM17, POM19, SAF-2, SAF-4, SAF-8, SAF-9, SAF-10, SAF-12, SAF-13, SAF-14, SAF22, SAF24, SAF-53, SAF-54, SAF-60, SAF-61, SAF-66, SAF-68, SAF-69, SAF-70, SAF-75, SAF-76, SAF-82, SAF83, SAF-84, SAF-95, Pri917, BAR215, BAR221, BAR224, BAR233, BAR234, Sha31, 11B9, 12F10, D18, 6H4 y BDI115.

8. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2 (a) ,

(a) en el que dicha proteasa específica del sitio está inmovilizada; o

(b) en el que dicho inhibidor de la proteasa es fluoruro de fenilmetilsulfonilo; o

(c) en el que dicha etapa de desnaturalización comprende tratar dicha muestra con un compuesto de guanidinio; y opcionalmente que comprende además una etapa de dilución de dicha muestra tras dicha etapa de desnaturalización; o

(d) en el que dicha etapa de desnaturalización se lleva a cabo exponiendo dicha muestra a pH alto o pH bajo; y opcionalmente que comprende además la etapa de desnaturalización de dicho pH alto o dicho pH bajo tras dicha etapa de desnaturalización; o

(e) en el que dicha muestra se obtiene de un organismo vivo o que ha vivido alguna vez; en el que opcionalmente dicho organismo vivo o que ha vivido alguna vez se selecciona del grupo que consiste en ser humano, mono, hámster, bovinos, oveja, ratón, alce y ciervo; o

(f) en el que dicha muestra se deriva del grupo que consiste en suministro de alimentos, sangre completa, productos sanguíneos, fracciones sanguíneas, componentes sanguíneos, plasma, plaquetas, suero, líquido cefalorraquídeo, órganos, células, tejido cerebral, tejido del sistema nervioso, tejido muscular, tejido graso, médula ósea, orina, lágrimas, tejido del sistema no nervioso, biopsias, necropsias e instrumentos contaminados; o

(g) en el que dicha muestra se deriva del grupo que consiste en sangre completa, productos sanguíneos, fracciones sanguíneas, componentes sanguíneos, plasma, plaquetas, glóbulos rojos y suero; o

(h) en el que dicha muestra se obtiene de una biopsia, autopsia o necropsia.

9. Un kit para detectar la presencia de una forma patógena de proteína priónica (PrPSc) que tiene un núcleo resistente a proteasa y una región de octarrepetición en una muestra que se sospecha que contiene dicha PrPSc, en el que dicha muestra puede contener o puede no contener una forma normal de proteína priónica (PrPC) , comprendiendo el kit:

(a) al menos una proteasa específica del sitio, en el que dicha proteasa específica del sitio es tripsina o S-V8,

i. en el que dicha PrPSc no tiene sitio de escisión para dicha proteasa dentro de dicha región de octarrepetición o entre dicha región de octarrepetición y dicho núcleo resistente a proteasa de manera que un fragmento de la región amino-proximal que incluye dicha región de octarrepetición sigue estando conectado a dicho núcleo resistente a proteasa tras una digestión proteolítica de PrPSc mediante dicha proteasa que da como resultado dicha PrPSc que está escindida en al menos el 90% de todos los sitios de escisión de proteasa disponibles, y

ii. en el que dicha PrPC tiene al menos un sitio de escisión disponible para dicha proteasa dentro de la región de aminoácidos que corresponde a dicho núcleo resistente a proteasa;

(b) opcionalmente, un inhibidor de la proteasa que puede inhibir la actividad de dicha proteasa;

(c) opcionalmente, un desnaturalizante que puede desnaturalizar dicha PrPSc;

(d) al menos dos componentes de unión, un primer componente de unión y un segundo componente de unión,

i. en el que dicho primer componente de unión se une específicamente a un primer epítopo que está ubicado dentro de dicho fragmento de la región amino-proximal que sigue estando conectado a dicho núcleo resistente a proteasa tras una digestión proteolítica de dicha PrPSc que da como resultado dicha PrPSc que está escindida en al menos el 90% de todos los sitios de escisión de proteasa disponible mediante dicha proteasa, y

ii. en el que dicho segundo componente de unión se une específicamente a un segundo epítopo que está ubicado dentro de dicho núcleo resistente a proteasa, en el que dicho segundo epítopo está en una región de dicha PrPC que está separada de dicho primer epítopo tras una digestión proteolítica de dicha PrPC que da como resultado dicha PrPC que está escindida en al menos el 90% de todos los sitios de escisión de proteasa disponible mediante dicha proteasa; y

(e) instrucciones para usar dicho kit para detectar la presencia de cualquier forma patógena de proteína priónica.

10. El kit según la reivindicación 9, en el que dicha PrPSc comprende una secuencia seleccionada de SEC ID N.os 1 a

10.

11. El kit según la reivindicación 9 ó 10,

(a) en el que dicho primer epítopo está dentro de dicha región de octarrepetición; en el que opcionalmente dicho primer componente de unión es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en POM2, POM11, POM12, POM14, 3B5, 4F2, 13F10, SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35 y SAF-37; o

(b) en el que dicho primer epítopo está fuera de dicha región de octarrepetición; en el que opcionalmente dicho primer componente de unión es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en BAR210, BAR231 y 14D3; o

(c) en el que dicha proteasa específica del sitio es tripsina; o

(d) en el que dicha proteasa específica del sitio es S-V8; en el que opcionalmente dicho segundo componente de unión es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en SAF-53, SAF54, SAF-60, SAF-61, SAF-66, SAF-69, SAF-70, SAF-75, SAF-76, Pri917, BAR234, Sha31, 11B9, 12F10, 6H4 y POM5; o

(e) en el que dichos componentes de unión son aptámeros; o

(f) en el que dichos componentes de unión son anticuerpos; en el que opcionalmente dichos anticuerpos son anticuerpos monoclonales; o

(g) en el que dicho kit comprende un kit ELISA.

12. El kit según la reivindicación 11 (g)

(a) en el que dicho primer componente de unión es un componente de unión de captura para capturar proteínas priónicas, y en el que dicho segundo componente de unión es un componente de unión de detección para detectar dicha PrPSc; o

(b) en el que dicho segundo componente de unión es como un componente de unión de captura para capturar proteínas priónicas, y en el que dicho primer componente de unión es como un componente de unión de detección para detectar dicha PrPSc.

13. El kit según la reivindicación 12 (a) o 12 (b) , en el que dicho componente de unión de detección está marcado; en el que opcionalmente dicho componente de unión de detección está marcado con un conjugado de fosfatasa alcalina.

14. El kit según la reivindicación 11 (c) ,

(a) en el que dicho segundo componente de unión es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en 3F4, POM1, POM4, POM5, POM6, POM7, POM8, POM9, POM10, POM 13, POM15, POM 16, POM 17, POM 19, SAF-2, SAF-4, SAF-8, SAF-9, SAF-10, SAF-12, SAF-13, SAF-14, SAF-22, SAF-24, SAF53, SAF-54, SAF-60, SAF-61, SAF-66, SAF-68, SAF69, SAF-70, SAF-75, SAF-76, SAF-82, SAF-83, SAF84, SAF-95, Pri308, Pri917, BAR215, BAR221, BAR224, BAR233, BAR234, Sha31, 11B9, 12F10, D18, 6H4 y BDI115; o

(b) en el que dicha PrPC contiene un dominio globular dentro de secuencias de aminoácidos que corresponde a dicho núcleo resistente a proteasa, y en el que dicho segundo epítopo está ubicado dentro de dicho dominio globular; en el que opcionalmente dicho segundo componente de unión es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en POM1, POM4, POM5, POM6, POM7, POM8, POM9, POM10, POM13, POM15, POM16, POM17, POM19, SAF-2, SAF-4, SAF-8, SAF-9, SAF-10, SAF-12, SAF13, SAF-14, SAF-22, SAF-24, SAF-53, SAF-54, SAF-60, SAF-61, SAF-66, SAF-68, SAF-69, SAF70, SAF75, SAF-76, SAF-82, SAF-83, SAF-84, SAF-95, Pri917, BAR215, BAR221, BAR224, BAR233, BAR234, Sha31, 11B9, 12F10, D18, 6H4 y BDI115.

15. El kit según la reivindicación 9 ó 10,

(a) en el que dicha proteasa específica del sitio está inmovilizada; o

(b) en el que dicho inhibidor de la proteasa opcional es fluoruro de fenilmetilsulfonilo; o

(c) en el que dicho desnaturalizante opcional es un compuesto de guanidinio; o

(d) en el que dicho desnaturalizante opcional es un reactivo básico o un reactivo ácido.