La presente invención se refiere al uso de un agente inhibidor de la actividad y/o expresión de ADAM-17 en la preparación de un medicamento,

o composición farmacéutica, para incrementar la regeneración neuronal en lesiones del sistema nervioso central en un mamífero, preferentemente humano, en necesidad de dicho tratamiento

Empleo de inhibidores de ADAM-17 en regeneración neuronal.

Campo de la invención La presente invención se enmarca en el campo de la biomedicina, ydentro de ésta en las áreas de neurologíay neurocirugía.En concreto está dirigidaal usode herramientasfarmacológicaso biotecnológicas parael tratamientode lesiones del sistema nervioso que requieran una regeneración neuronal a partir de células madre neurales. De forma específica, se describe el empleo de agentes inhibidores de la actividad y/o expresión de ADAM-17 en la preparación de un medicamento para incrementar la regeneración neuronalen lesiones del sistema nervioso central en un mamífero en necesidad de dicho tratamiento.

Antecedentes de la invención Las enfermedades neurológicasdemayorprevalenciayrelevanciasocialestáncausadasporunapérdidairreversible de neuronas en distintas zonas del sistema nervioso central.

El sistema nervioso central (SNC) está compuesto por el encéfalo, protegido por los huesos del cráneo, y su continuación inferior, la médula espinal, ubicada en el conducto raquídeo. El tejido nervioso está formado pordos tipos de células neuronas y células gliales, incluyendo éstas últimas los astrocitos y oligodendrocitos. Los somas neuronales se encuentran agrupados en estructuras o núcleosy forman la llamada sustancia gris, mientras que las prolongaciones de las neuronas, o fibras nerviosas, a veces de gran longitud, constituyen la sustancia blanca. Como ejemplosde estructuras del sistema nervioso central relevantes parala descripciónde estainvención se pueden citarla corteza cerebral, el hipocampo, la sustancia negra o la médula espinal.

Muchas enfermedades del sistema nervioso central, entre ellas algunas de las de mayor prevalencia, son de tipo neurodegenerativo, es decir se producen como consecuencia de la muerte neuronal. Entre ellas, las más frecuentes son la enfermedad de Alzheimer, con pérdida neuronal en el hipocampo y corteza cerebral fundamentalmente, la enfermedaddeParkinson, con muerte selectivade neuronas enla sustancianegra, ola esclerosis lateral amiotrófica (ELA) , con déficit de neuronas en la médula espinal. En otras entidades nosológicas de alta frecuencia, como los accidentes vasculares cerebrales, también se produce una destrucción neuronal, tanto durante el periodo de isquemia como duranteel iniciodela reperfusión. Por último, la pérdida neuronal también ocurre en traumatizados, tanto enel cerebro como en la médula espinal.

Ninguna de las alteraciones del sistema nervioso central que cursan con pérdida de neuronas tiene tratamiento eficaz actualmente, siendola búsquedade opciones terapéuticas unode los camposdeinvestigaciónmásactivos enla biomedicina.En este sentido, el descubrimiento del papelde las células madre tanto enlageneración inicial como en la regeneración de diversos tejidos ha abierto un nuevo enfoque en las perspectivas terapéuticas para estas enfermedades.

Reposición neuronala partirde células madre en condiciones fisiológicasypatológicas Las células madre neurales son células indiferenciadas que cuando se dividen generan células iguales a sí mismas y células capaces de diferenciarse a cada uno de los tipos celulares propios del tejido nervioso: neuronas, astrocitosyoligodendrocitos.Duranteel desarrollo embrionario todoel tejido nerviososegeneraa partirde célulasmadre neurales. Recientemente se ha demostrado que durante la vida adulta existen células madre neurales en distintas zonasdel cerebro, que permanecen quiescentes, peroquesiseextraeny se ponenenel laboratorioenlas condiciones adecuadaspuedendarlugara nuevas neuronasycélulas gliales (Goldman, S. Gliaas neuralprogenitor cells.Trends in Neurosci. 26:590-596, 2003; Magavi, S.S. et al. Induction of neurogenesis in the neocortex of adult mice. Nature 405:951-955, 2000;Arsenijevic, Y. etal. Isolationof multipotent neuralprecursorsresidinginthe cortexofthe adult human brain. Exp. Neurol. 170:48-62, 2001) . En dos zonas concretas, el giro dentado del hipocampoyla zona subventricular, estas células madre neurales están permanentemente activadas, se dividenygeneran progenitores ya comprometidos con la estirpe neuronal, llamados neuroblastos, cuya posterior diferenciación da lugar a neuronas maduras (Gage, F. H. Structural plasticity: cause, result, or correlate of depression. Biol Psychiatry, 48:713-714, 2000; Alvarez-Buylla, A. and Garcia-Verdugo, J. M. Neurogenesis in adult subventricular zone.JNeurosci. 22:629634, 2002) . Este proceso se conoce con el nombre de neurogénesis.Para que haya neurogenesis son necesarios dos requisitos:1) debenexistir células madre capacesde generar neuroblastosy2) esas células madre deben encontrarse enun entorno adecuado, quefavorezcala diferenciación haciala estirpe neuronal (Alvarez-Buylla, A. and Lim, D. A. For the long run: maintaininggerminal nichesin the adultbrain. Neuron 41:683-686, 2004) .El conjuntodefactores que determinan ese entornose conoce conel nombrede microambienteo nicho neurogénico.Las zonas anteriormente mencionadas, el giro dentado del hipocampo en distintas especiesy la zona subventricular, especialmente desarrollada en roedores, cumplen los dos requisitosy son una fuentede nuevas neuronasalo largodela vida adulta.Sin embargo, las células madre presentes en otras zonas, o las que eventualmente podrían ser transplantadas, no podrían generar neuronasa menos que segenerara el entorno molecular necesario para ello. Porlo tanto, un objetivodela investigación actualen este temaes establecerqué moléculasfavorecen o impidenla neurogénesis para, mediante la inserción de las primeras y/o la eliminación de las segundas, tratar de generar un nicho neurogénico donde sea necesario.

La neurogénesis en el cerebro adulto es un fenómeno dinámico, habiéndose demostrado que puede modificarse en funciónde ciertosfactores ambientales. Así, el ejercicio físicoolos entornos enriquecidos en estímulosfavorecen la neurogénesis en el hipocampo (Kempermann, G.et al. More hippocampal neurons in adult mice living in an enrichedenvironment. Nature, 386:493-495, 1997;Kempermann, G.andGage, F.H. Experience-dependentregulation of adult hippocampal neurogenesis: effects of long-term stimulation and stimulus withdrawal. Hippocampus 9:321332, 1999;Van Praag, H. et al. Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus. Nat Neurosci, 2:266-270, 1999) , mientras que la estimulación olfativa la aumenta en la zona subventricular (Rochefort, C., etal. Enriched odorexposure increasesthe numberofnewborn neuronsinthe adult olfactorybulb and improves odor memory.JNeurosci, 22:2679-2689, 2002) . En distintos tipos de lesiones cerebrales experimentales (isquemia transitoria global o focal, epilepsia, entre otras) se ha descrito la aparición de nuevas neuronas en la zona lesionada, que se han podido generar in situ por activaciónde células madrelocales, o serel resultadode la migración de precursores desde las áreas neurogénicas. En este sentido se ha observado un aumento de la proliferación de precursores neurales en el giro dentado (Liu, J. et al. Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia ingerbils.JNeurosci 18:7768-7778, 1998.; Jin, K. et al. Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat. Proc Natl Acad Sci USA 98:47104715, 2001;Parent, J.M. etal. Dentategranulecellneurogenesisisincreasedbyseizuresand contributestoaberrant networkreorganizationin the adultrat hippocampus.J Neurosci. 17:3727-3738, 1997) yen la zona subventricular (Fallon, J. et al. In vivo induction of massive proliferation, directed migration, and differentiation of neural cells in the adult mammalian brain. Proc Natl Acad Sci USA 97:14, 686-14, 691, 2000) , dando lugar a la producción de nuevos neuroblastos que, eventualmente, migran en dirección ala zona lesionada. Cualquiera que sea su origen, la capacidad de regeneración es muy escasa, habiéndose descrito una reposición neuronal entre 0, 2y 10%, según el área afectadayel tipo de lesión (Arvidsson, A. et al. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat Med 8:963-970, 2002; Nakatomi, H. et al. Regeneration of hippocampalpyramidal neurons after ischemicbraininjury, byrecruitmentof endogenous neuralprogenitors. Cell 110:429-441, 2002;Teramoto, T. et al. EGF amplifies the replacement of parvalbuminexpressing striatal interneurons after ischemia. J Clin Invest. 111:1125-1132, 2003) . El hecho de que haya una respuesta neurogénica a la lesión hace pensar que la formación de nuevas neuronas sea un mecanismo eficaz en la reparación de pequeñas lesiones, que permanecen silentes precisamente porque las neuronas que hacen... [Seguir leyendo]

1. Uso de un agente inhibidor de la actividad y/o expresión de ADAM-17 en la preparación de un medicamento parafavorecerlaregeneración neuronalen lesionesdel sistema nervioso centralenun mamíferoen necesidaddedicho tratamiento.

2. Uso de un agente inhibidor, según la reivindicación 1, donde la regeneración neuronal se produce a partir de precursores neurales endógenos.

3. Uso de un agente inhibidor, según la reivindicación 1, donde la regeneración neuronal se produce a partir de transplantes de células madre neurales o precursores neurales.

4. Uso de un agente inhibidor, según la reivindicación 1, donde dicho agente es un inhibidor de la actividad general de las metaloproteasas.

5. Uso de un agente inhibidor, según la reivindicación 4, donde dicho agente es la molécula GM6001.

6. Uso de un agente inhibidor, según la reivindicación 1, donde dicho agente es un inhibidor específico de la actividad de la proteína ADAM-17.

7. Uso de un agente inhibidor, según la reivindicación 6, seleccionado entre una sustancia de naturaleza química, nucleotídica, peptídica o proteica que bloquea o disminuye la actividad de la proteína ADAM-17.

8. Uso de un agente inhibidor, según la reivindicación 7, donde el agente inhibidor comprende una molécula de ADN que codifica para un péptidoo proteína que bloqueao disminuyela actividaddelaproteínaADAM-17.

9. Uso de un agente inhibidor, según la reivindicación 8, donde la molécula de ADN codifica para una forma mutante dominante negativodela proteínaADAM-17.

10. Uso de un agente inhibidor, según la reivindicación 1, donde el inhibidor es una secuencia de nucleótidos que impide o disminuye la expresión del gen codificante de la proteína ADAM-17.

11. Uso de un agente inhibidor, según la reivindicación 10, donde el inhibidor es una secuencia de nucleótidos antisentido específica de la secuencia del gen ADAM-17 o del ARNm que codifica para la proteína ADAM-17.

12. Uso de un agente inhibidor, según la reivindicación 11, donde la secuencia de nucleótidos antisentido está dirigida contra cualquier región del ARNm que codifica para la proteína ADAM-17.

13. Uso de un agente inhibidor, según la reivindicación 10, donde el inhibidor es una ribozima específica del ARNm de la proteína ADAM-17.

14.Usodeun agente inhibidorsegúnlareivindicación10, dondeel inhibidoresunaptámero específicodelARNm de la proteína ADAM-17.

15. Uso de un agente inhibidor, según la reivindicación 10, donde el inhibidor es un ARN de interferencia (ARNi) específico del ARNmdelaproteínaADAM-17.

16. Uso de un agente inhibidor, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el medicamento comprende además al menos un vehículo y/o al menos un excipiente y/o al menos un aditivo y/o al menos otro ingrediente activofarmacéuticamente aceptables.

17. Uso de un agente inhibidor, según la reivindicación 16, donde el medicamento comprende además un agente inhibidor de la actividad y/o expresión de EGFR.

18. Usode un agente inhibidor, segúnla reivindicación17, dondeel agente inhibidorde EGFR se usa simultánea, secuencialo separadamente conel agente inhibidordela actividady/oexpresióndeADAM-17.

19.Usodeun agente inhibidor, segúnlareivindicación1, dondeel medicamentose administra directaylocalmente sobre la lesión cerebral.

20. Uso de un agente inhibidor, según la reivindicación 19, donde la administración se lleva a cabo mediante sistemas de perfusión.

21. Usode un agente inhibidor, segúnla reivindicación1, dondeel medicamento se administrade forma indirecta por vía oral, inyección intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.

22. Usode un agenteinhibidor, según cualquierade las reivindicaciones anteriores, donde las lesiones del sistema nervioso central están causadas por trauma, isquemia cerebral o enfermedades neurodegenerativas.

23. Uso de un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un inhibidor de la actividad y/oexpresióndeADAM-17, talycomo aparece definidoen cualquieradelasreivindicaciones8-15, enla preparación de un medicamento parafavorecer la regeneración neuronal en lesiones del sistema nervioso central en un mamífero en necesidad de dicho tratamiento.

24. Uso de un vector, según la reivindicación 23, donde dicho vector es un vector de expresión.

25. Uso de un vector, según la reivindicación 24, donde el vector es plasmídico y/o vírico.

26. Uso de un vector, según la reivindicación 25, donde el vector es lentiviral o adenoviral.

27. Composiciónfarmacéutica que comprende un agente inhibidordela actividady/oexpresióndeADAM-17, taly como aparece definido en cualquiera de las reivindicaciones1-26, parafavorecer la regeneración neuronal en lesiones del sistema nervioso central.

28. Métodode screeningpara identificar agentesquefavorezcanlaregeneración neuronalen lesionesdel sistema nervioso central que comprende:

a. poner en contactoel genoproteínaADAM-17 conel agentea ensayar, y

b. determinar si el agente inhibe la actividad y/o expresión de dicho gen o proteína.

LISTADE SECUENCIAS

<110> Universidad de Cádiz

<120> EMPLEODE INHIBIDORESDEADAM-17EN REGENERACIÓN NEURONAL

<130> --

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 824

<212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<223> ADAM-17

ES2361 312A1

ES2361 312A1

<210> 2

<211> 1698

<212> DNA

<213> Homo sapiens <220>

<223> Secuencia Mutante ADAM17 deleción T.

21. 473

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> Secuencia antisentido dirigida contra el mRNAde ADAM-17 humana <400> 3

<210> 4

<211> 827

<212> PRT

<213> Mus musculus <220>

<223> Adam-17

ES2361 312A1

ES2361 312A1

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> artificial <220>

<223> siRNAcontra el mRNAde la proteína Adam17 de ratón <400> 5

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> artificial <220>

<223> siRNAcontra el mRNAde Adam17 de ratón <400> 6

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> artificial <220>

<223> siRNAcontra el mRNAde Adam17 de ratón <400> 7

<210> 8

<211> 19

<212> RNA

<213> artificial <220>

<223> siRNAcontra el mRNAde Adam17 de ratón <400> 8

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> cebador Fw de la proteína EGF de ratón <400> 9

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> cebador Rw de EGF de ratón <400> 10

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> cebador Fw de TGF-alfa de ratón <400> 11

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> cebador Rw de TGF-alfa de ratón <400> 12

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> cebador FW de HB-EGF de ratón <400> 13

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> cebador Rw de HB-EGF de ratón <400> 14

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> cebador Fw de anfiregulina de ratón <400> 15

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> cebador Rw de anfiregulina de ratón <400> 16

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> cebador Fw de TBP de ratón <400> 17

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> cebador Rw de TBP de ratón <400> 18

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> cebador Fw de GAPDH de ratón <400> 19

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> cebador Rw de GAPDH de ratón <400> 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> cebador Fw de Adam17 de ratón <400> 21

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> cebador Rw de Adam17 de ratón <400> 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> cebador Fw de Adam10 de ratón <400> 23

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> cebador Rw de Adam10 de ratón <400> 24

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> cebador Fw de Adam21 de ratón <400> 25

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> cebador Rw de Adam21 de ratón <400> 26

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> cebador Fw de Adam12 de ratón <400> 27

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> cebador Rw de Adam12 de ratón <400> 28